La actuación dinámica mejora el transporte y extiende la vida útil terapéutica en una plataforma de administración de fármacos implantable

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4496 (2022) Citar este artículo

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La formación de cápsulas fibrosas (FC), secundaria a la respuesta de cuerpo extraño (FBR), impide el transporte molecular y es perjudicial para la eficacia a largo plazo de los dispositivos implantables de administración de fármacos, especialmente cuando es necesario un control temporal ajustable. Informamos sobre el desarrollo de una plataforma de administración de fármacos mecanoterapéuticos implantables para mitigar y superar esta respuesta inmune del huésped utilizando dos estrategias robóticas blandas distintas, pero sinérgicas. En primer lugar, la activación intermitente diaria (ciclos a 1 Hz durante 5 minutos cada 12 horas) preserva la administración rápida a largo plazo de un fármaco modelo (insulina) durante 8 semanas de implantación, al mediar la inmunomodulación local de la RBA celular e inducir FC temporal multifásica cambios. En segundo lugar, la liberación rápida de la terapia mediada por activación puede mejorar el transporte de masa y el efecto terapéutico con un control temporal ajustable. En un paso hacia la traducción clínica, utilizamos un enfoque percutáneo mínimamente invasivo para implantar un dispositivo ampliado en un modelo cadavérico humano. Nuestra plataforma accionable suave tiene una utilidad clínica potencial para una variedad de indicaciones en las que el transporte se ve afectado por la fibrosis, como el tratamiento de la diabetes tipo 1.

Nuestro sistema inmunológico ha evolucionado para adquirir un mecanismo de defensa robusto contra la invasión de cuerpos extraños. En presencia de un 'objeto extraño', la infiltración de neutrófilos inicia una cascada de procesos inflamatorios y de cicatrización de heridas, lo que precipita la formación de una cápsula fibrosa (FC) densa y encapsulante1,2. La respuesta a cuerpo extraño (FBR) minimiza la exposición a toxinas potenciales y, a menudo, es ventajosa; por ejemplo, los soldados con heridas de bala rara vez desarrollan síntomas clínicos de envenenamiento por plomo3,4.

Sin embargo, esta respuesta protectora es perjudicial para la durabilidad a largo plazo de los dispositivos biomédicos implantables, como los implantes mamarios5,6, las válvulas cardíacas7 y los marcapasos8. Estos dispositivos han transformado la atención moderna de los pacientes, pero la infiltración inmunitaria y la respuesta fibrótica pueden anular la función del dispositivo con el tiempo, lo que requiere una revisión dolorosa o una cirugía de reemplazo. Esta barrera fibrosa es especialmente perjudicial para los biosensores, como los monitores continuos de glucosa y los dispositivos de liberación controlada de fármacos, como las bombas de insulina, que se basan en la comunicación interactiva con su entorno tisular local9,10,11. En tales casos, la formación de una cápsula hipopermeable puede impedir el transporte de moléculas, tanto hacia12 como desde13,14 del implante, y conducir al fracaso de la terapia.

Un ejemplo pertinente es el manejo de la diabetes tipo 1, una enfermedad crónica que afecta a 18 millones de personas en todo el mundo, con una carga económica anual de más de $90 mil millones de dólares (Estudio: Terapias modificadoras de enfermedades necesarias para compensar los costos de la diabetes tipo 1 - Investigación de diabetes juvenil Base). La implementación exitosa y la adopción clínica de un páncreas artificial que combine el control continuo de la glucosa con la liberación rápida y receptiva de insulina (o glucagón) mejoraría enormemente los resultados y la calidad de vida de esta población de pacientes. El desarrollo de un sistema de administración de insulina de circuito cerrado completamente automatizado reduciría la carga del usuario, eliminaría la necesidad de múltiples inyecciones diarias y aumentaría el tiempo que se pasa en el rango óptimo de glucosa en sangre, lo cual es imperativo para la prevención de complicaciones diabéticas a largo plazo. Desafortunadamente, los esfuerzos actuales para desarrollar un dispositivo de este tipo se han visto obstaculizados por el FBR dinámico e impredecible, lo que lleva a una inexactitud en la detección de glucosa, inhibición de la liberación de insulina y pérdida gradual de la funcionalidad en las semanas o meses posteriores a la implantación4,15,16,17. Mirando hacia el futuro, los implantes vivos que contienen células β pancreáticas derivadas de células madre representan una cura potencial para la diabetes. Sin embargo, la atenuación del transporte molecular y de oxígeno debido a la barrera FC todavía constituye un obstáculo importante para la traducción clínica exitosa de estos implantes9,10,18,19. Es evidente que un método para (i) mitigar la FBR o (ii) mejorar el transporte a través de la FC podría transformar el manejo de esta enfermedad generalizada. Además, dicho método podría tener implicaciones más amplias para una variedad de enfermedades y tratamientos basados ​​en dispositivos afectados por la FBR.

Las estrategias convencionales para mitigar la FBR se han centrado en cambiar los atributos del propio material del implante, como su tamaño, forma, topografía y revestimiento de la superficie20,21,22,23,24,25,26,27,28, o han implicado la concomitante administración de fármacos modificadores de FBR, como agentes antiinflamatorios esteroideos, antifibróticos y antiproliferativos29. Si bien estas estrategias se han mostrado prometedoras, no han logrado desarmar completamente a la FBR y tienen varias limitaciones. En primer lugar, los materiales generalmente están prediseñados para apuntar solo a un componente o punto de tiempo de una respuesta inmune que es multifacética y temporalmente dinámica. En segundo lugar, el uso de terapias modificadoras de FBR presenta problemas de seguridad debido a los efectos adversos no deseados y la toxicidad local30,31,32. La administración sistémica sostenida de tratamientos como los antiinflamatorios no esteroideos se asocia con una serie de toxicidades en el hígado, los riñones, el corazón y el tracto gastrointestinal32. La administración local dirigida puede reducir los efectos fuera del objetivo, pero aún puede afectar negativamente al tejido subyacente o interferir con el mecanismo de acción del dispositivo implantable. Por ejemplo, la administración local de dexametasona puede mitigar la FBR, pero no sin suprimir la regeneración del tejido subyacente33. Además, el efecto de la inmunosupresión a largo plazo sobre el comportamiento y el secretoma de la terapia basada en células no está claro. Finalmente, un depósito local de drogas es finito, a menudo dura de 1 a 2 meses, mientras que muchas necesidades son de por vida32. Por lo tanto, según la farmacología del fármaco y el contexto clínico, la respuesta inmunitaria y fibrótica puede recuperarse una vez que se disipan los efectos residuales de la inhibición del fármaco. Por lo tanto, sería muy deseable un método a largo plazo sin drogas que pueda modular y adaptarse a la FBR con el tiempo para abordar estas limitaciones.

La alteración dinámica del entorno biomecánico local en el sitio del implante es uno de esos enfoques prometedores, aunque poco explorados, sin fármacos34. Las células de nuestro cuerpo son exquisitamente sensibles a su entorno mecánico, y la carga desempeña un papel fundamental en funciones celulares como la diferenciación35, la proliferación36 y la migración37. Históricamente, los estudios han observado el estrés biomecánico como un estímulo profibrótico o regenerativo1, lo que demuestra que la aplicación de estiramiento38,39,40, flujo de fluido41,42 o compresión43 a las células puede conducir a un aumento del depósito de matriz de colágeno. En consecuencia, muchas estrategias anti-FBR se han centrado en minimizar el desajuste mecánico, la tensión interfacial y el movimiento entre el implante y el tejido local. Nuestra investigación busca desafiar este status quo y revela el potencial de una mecanoterapia dinámica que utiliza tensión tisular atraumática y de baja magnitud y flujo convectivo como mecanismo de defensa contra el FBR celular invasor. Curiosamente, algunos estudios han observado que la carga dinámica de pequeña magnitud tiene efectos antiinflamatorios y pro-regenerativos. Trabajos previos que aplican cargas dinámicas al tejido han utilizado estímulos mecánicos, neumáticos o magnéticos diarios, ya sea interna o externamente, para aplicar cargas cíclicas, induciendo deformaciones que van del 4 al 50%, con cada ciclo durando entre 1 s y 10 min44,45, 46,47,48,49,50. Estos estudios han demostrado efectos beneficiosos en términos de vascularización44,45,50, regeneración tisular funcional46,49 y expresión génica antiinflamatoria47. Estos trabajos previos sobre carga mecánica han indicado la presencia de un umbral terapéutico, más allá del cual se produce daño tisular e inflamación47,49.

El trabajo anterior de nuestro grupo demostró un efecto atenuante de la fibrosis provocado por un reservorio blando dinámico después de la implantación aguda34. Aquí, nos basamos en este trabajo e introducimos un reservorio de aumento de transporte suave (STAR) que puede mitigar persistentemente el FBR dinámico y mantener una comunicación molecular rápida y a largo plazo con su entorno tisular utilizando dos estrategias de actuación robótica suave distintas y sinérgicas: intermitente activación (IA) y liberación rápida mediada por activación (RR). Es importante destacar que arrojamos luz sobre los fundamentos mecánicos de la IA y revelamos un efecto inmunomodulador en la fase aguda de la implantación, con una reducción significativa de la infiltración de neutrófilos en el sitio pericapsular, seguida de cambios capsulares temporales multifásicos con la implantación crónica. Por último, en un paso hacia la traducción clínica, demostramos la administración percutánea mínimamente invasiva de un dispositivo STAR a escala humana.

Nuestro laboratorio demostró previamente el potencial de atenuación fibrótica de un dispositivo dinámico durante las etapas iniciales de la FBR (2 semanas)34. Con base en este trabajo fundamental, proponemos que la aplicación de activación intermitente, cíclica y de baja amplitud puede actuar como un escudo oscilante contra el FBR multifásico invasor, inducir efectos inmunomoduladores locales y crear un entorno favorable para el transporte rápido a largo plazo de macromoléculas. tratamiento farmacológico (fig. 1a).

a Mecanismo propuesto de STAR: la actuación intermitente atenúa la respuesta a cuerpo extraño, creando un entorno favorable para el transporte rápido a largo plazo de la terapia farmacológica macromolecular. b Vista explosionada que muestra las diferentes capas que componen STAR. c Desviación de la actuación y capas porosas durante la actuación. d Un prototipo de STAR que muestra la desviación de la capa porosa durante un ciclo de actuación. La barra de escala es de 5 mm. e Modelo FE que muestra la velocidad del fluido periimplantario del flujo convectivo durante la actuación. f Modelo FE que estima la máxima tensión tisular principal inducida por la actuación.

Para probar esta hipótesis, primero diseñamos un reservorio adecuado para la implantación de tejido a largo plazo y la administración precisa y repetible tanto del fármaco como de la terapia de actuación. La Figura 1b muestra la composición multicapa de STAR, con un diseño de bajo perfil que minimiza la presencia de ángulos o bordes agudos que pueden exacerbar el FBR51,52. Una cámara terapéutica se encuentra en contacto directo con el tejido subyacente y está separada por una membrana con una matriz de poros de 10 μm (Fig. 1 complementaria). Una línea de catéter permanente conectada permite la administración de terapia farmacológica con control temporal (Fig. 1b, c). Superpuesta a la cámara terapéutica hay una cámara de actuación que se puede presurizar para provocar la oscilación controlada de la membrana porosa en contacto con el tejido (Fig. 1c, d; Película complementaria 1). También se sabe que los desequilibrios entre las propiedades mecánicas del implante y el tejido circundante exacerban la formación de CF, y los implantes más rígidos provocan una mayor respuesta inmunitaria52. Por este motivo, STAR se fabricó a partir de poliuretano termoplástico (TPU) con un módulo de elasticidad de ~15 MPa (fig. 1d), similar al de la matriz extracelular53,54. STAR se puede escalar fácilmente entre modelos animales utilizando moldes impresos en 3D y un proceso simple de termoformado/sellado térmico (Figura complementaria 2).

Como parte del diseño y la optimización del dispositivo, realizamos simulaciones de elementos finitos (FE) para comprender los cambios biomecánicos mediados por la actuación, en particular las relaciones entre la desviación de la membrana, el flujo convectivo y la tensión del tejido (Fig. 1e, f; Fig. 3 complementaria). Sobre la base de los resultados informados recientemente49, diseñamos nuestra estrategia de actuación robótica suave para inducir una tensión tisular que estaría dentro del rango atraumático (<40 %) y planteamos la hipótesis de que este régimen mitigaría la FBR al crear un flujo convectivo disruptivo para la respuesta inmunitaria celular.

Después del diseño y la fabricación de STAR, a continuación desarrollamos un método para monitorear longitudinalmente el efecto perjudicial y progresivo del FBR en el transporte de la terapia (Fig. 2a). La insulina fue elegida como nuestro fármaco macromolecular modelo para permitir una medición en tiempo real y dependiente de la dosis de la respuesta funcional a medida que la insulina cruza el FC y entra en el torrente sanguíneo.

un esquema que demuestra el efecto perjudicial de la formación de cápsulas fibrosas (FC) en la administración de la terapia con el tiempo. b Respuesta de la glucosa en sangre (BG) a la insulina humana administrada a través de STAR, medida durante 120 min al inicio (BL, día 3), semana 2 y semana 3. n = 5 ratones en cada punto de tiempo. c Evolución temporal de la caída máxima del % de GS (que denota efecto funcional), calculada a partir de b. d Rebanada representativa de µCT 2D de STAR con encapsulación fibrosa. La barra de escala es de 1 mm. e Grosor promedio de FC que encapsula STAR al inicio (día 3), semana 2 y semana 3 después de la implantación. n = 3 ratones al inicio y 2 semanas, 5 ratones a las 3 semanas. Los datos son medias ± error estándar de la media. f Relación entre el grosor de la FC y el efecto máximo de la insulina medido por la reducción del nivel de glucosa en sangre. g Simulaciones multifísicas de COMSOL que muestran la difusión espacial de fármacos a través de FC de diferentes espesores. h Evolución temporal del porcentaje de liberación del fármaco para diferentes espesores de FC.

Primero, implantamos dispositivos STAR estáticos (sin IA) en la parte dorsal subcutánea de ratones C57BL/6 (Fig. 4 complementaria). A continuación, inyectamos insulina humana de acción corta en el dispositivo y monitoreamos la liberación basada en la difusión a través del FC en la circulación sistémica a través de mediciones de glucosa en sangre en serie en el día 3 (línea de base, BL), 2 semanas y 3 semanas después de la implantación (Fig. 2b).

La eficacia funcional de una dosis equivalente de insulina disminuyó con el tiempo de implantación y con la progresión de la RBA, como lo indica la caída máxima de glucosa en sangre (BG) (Fig. 2c) y el área bajo la curva de BG (AUC; Fig. 5a complementaria). b). Para corroborar estos resultados, analizamos longitudinalmente el grosor de la CF mediante microtomografía computarizada 2D (µCT; Fig. 2d) y lo relacionamos con estos resultados funcionales. Como era de esperar, el grosor de la cápsula aumentó con el tiempo (Fig. 2e). Es importante destacar que observamos una relación lineal inversa (r = -0.929) entre el espesor de FC y las métricas de eficacia de la insulina (Fig. 2f, Fig. 5c complementaria).

En un paso final de validación, examinamos el efecto del espesor de FC en la liberación de la terapia mediante un modelo de difusión computacional multifísica. Nuestras simulaciones corroboran nuestros resultados experimentales, lo que también indica que el aumento del grosor de la FC tiene un efecto pronunciado en el transporte del fármaco (Fig. 2g), introduciendo un retraso de tiempo para que la concentración terapéutica deseada atraviese la cápsula y provoque un efecto funcional (Fig. 2h).

En resumen, estos datos demuestran el desarrollo y la validación de un modelo preclínico que puede detectar cambios en tiempo real en la formación de FC a través de su efecto en el transporte macromolecular y rastrear estos cambios a lo largo del tiempo.

Después del desarrollo del modelo in vivo y del dispositivo, diseñamos un estudio preclínico longitudinal de 8 semanas para probar la capacidad de STAR para modular la FBR y mejorar la administración macromolecular en la FC formada.

Implantamos dispositivos STAR (sin fármaco) en la cara subcutánea dorsal de tres grupos de ratones (Fig. 3a). En dos grupos experimentales, realizamos IA habilitado para STAR con entrada de presión cíclica de 2 psi a 1 Hz durante 5 min cada 12 h utilizando un sistema de control neumático hecho a medida (Fig. 6 complementaria). Un grupo (8W IA) se accionó intermitentemente durante la duración total del estudio de 8 semanas, mientras que el segundo grupo (3W IA) recibió 3 semanas de IA seguido de ninguna activación durante el resto del estudio. Un tercer grupo que no recibió IA sirvió como control. Luego, inyectamos insulina humana de acción corta (2 UI/kg) en el dispositivo en varios momentos posteriores a la implantación: 2, 3, 4, 5 y 8 semanas, así como el día 3, que sirvió como BL. Supervisamos el transporte pasivo basado en la difusión a través de la FC formada y hacia el torrente sanguíneo a través de mediciones de glucosa en sangre en serie en estos puntos de tiempo.

una línea de tiempo de estudio preclínico utilizada para evaluar el efecto de IA en el transporte de insulina a través de una cápsula fibrosa. b Respuesta de la glucosa en sangre (GS) a la insulina humana, medida durante 120 min en el día 3 (línea de base), la semana 3 y la semana 8. c Cambio máximo del % de GS en el punto de tiempo de 8 semanas. d Tiempo para lograr una caída del 30 % en el nivel de GS, medido longitudinalmente. e Curvas de incidencia acumulada que demuestran la probabilidad de lograr una caída de GS del 30 % en 120 min para todos los grupos tanto al inicio (3 días) como a las 8 semanas. f Área bajo la curva de % de GS (AUC) que indica el efecto funcional general mapeado durante la duración del estudio. Comparaciones estadísticas con el grupo de control. g Cambio en el AUC desde el punto de tiempo de 3 semanas. Los datos son medias ± error estándar de la media; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Consulte la Nota complementaria 1 para obtener análisis estadísticos detallados. † El estudio de referencia se realizó post-hoc con ratones separados. # Los ratones de control se retiraron del estudio en puntos de tiempo intermedios debido al daño autoinfligido del dispositivo con la subsiguiente disminución de n.

Al inicio, la administración de insulina produjo una caída similar en la glucosa en sangre tanto en el grupo IA como en el de control (Fig. 3b, Nota complementaria 1). Durante 8 semanas, las curvas de glucosa en sangre se separan, con una disminución de la respuesta a la insulina en los grupos de control y 3W IA, en comparación con el grupo 8W IA. Sorprendentemente, el grupo 8W IA mantuvo su rápida caída de glucosa en sangre durante toda la duración del estudio (Fig. 3b). A pesar de la implantación crónica y el desarrollo de FC, no hubo diferencia estadística en la caída máxima de glucosa en sangre a los 3 días (BL; 72,5 ± 2,2 %) y 8 semanas (68,3 ± 3,4 %) posteriores a la implantación en el grupo 8W IA (Fig. 3c , Nota complementaria 1). Por el contrario, el grupo de control logró solo una caída máxima de glucosa en sangre de 20,9 ± 4,3 % en el punto de tiempo de 8 semanas, lo que refleja una pérdida casi completa de la funcionalidad de administración del fármaco debido al aislamiento del implante por parte del FC. El grupo 3W IA tuvo una pérdida de función similar, con una caída máxima de glucosa en sangre que no fue significativamente mejor que el control al final del estudio (consulte la Nota complementaria 1 para obtener detalles).

El tiempo medio para lograr una respuesta fisiológicamente relevante (caída del 30 % en la glucosa en sangre) se conservó en menos de 30 min en el grupo 8W IA durante toda la duración del estudio (Fig. 3d, Nota complementaria 1), y todos los ratones lograron este 30 % de caída dentro de los 48 min a las 8 semanas (Fig. 3e). Por el contrario, el tiempo medio hasta el efecto para los grupos control y 3W IA aumentó progresivamente con el tiempo de implantación. El tiempo medio hasta el efecto terapéutico aumentó a > 65 min en el grupo 3W IA (con 2 de 5 ratones que no respondieron) en la semana 8, y no fue detectable dentro del marco de tiempo experimental de 120 min en el grupo de control (Fig. 3d, e , Nota complementaria 1). En particular, los dispositivos IA de 8 W lograron una caída terapéutica de glucosa en sangre dos veces más rápida que los dispositivos de control a las 4 semanas (tiempo medio para una caída del 30 %: 27,43 ± 4,48 min frente a 73,55 ± 14,85 min) y cuatro veces más rápido a las 8 semanas ( 26,33 ± 6,16 min frente a >120 min).

Cuando el tiempo y la magnitud se integraron mediante el cálculo del AUC (Fig. 5a complementaria), 8W IA produjo un efecto de tratamiento sólido con beneficios significativos en la administración del fármaco en todos los puntos de tiempo en comparación con el grupo de control (Fig. 3f, Nota complementaria 1). La interrupción de la activación a las 3 semanas en el grupo 3W IA condujo a un empeoramiento de la respuesta de la insulina, con una progresión del AUC paralela al grupo de control (Fig. 3g). Aunque parece haber una tendencia hacia un mejor efecto funcional en el 3W IA en comparación con el control en los puntos de tiempo posteriores, esto no fue estadísticamente significativo, lo que implica que se necesitará una dosificación mecánica continua para efectos beneficiosos sólidos a largo plazo en el transporte (Fig. 3f, g). En general, estos datos sugieren que la IA puede mitigar la FBR y extender la vida útil terapéutica de los dispositivos implantables de administración de fármacos.

Luego de completar nuestro estudio preclínico, nos dispusimos a analizar las diferencias en la composición de FC en puntos de tiempo en evolución para comprender mejor los cambios celulares multifásicos y los impulsores clave del transporte mejorado de fármacos causado por IA (Fig. 4a).

a Cronología de cambios multifásicos celulares y de cápsula fibrosa (FC) inducidos por IA. b Imágenes fluorescentes representativas de la FC teñidas con Ly-6G+ (verde) y DAPI (azul). Las barras de escala son de 20 µm. c Cuantificación de neutrófilos presentes en FC+/− IA en los días 3 y 5. d Imágenes fluorescentes representativas de la FC teñidas con α-SMA (verde) y CD31 (rojo). Las barras de escala son de 50 µm. e Cuantificación de miofibroblastos presentes en FC+/− IA a las 2 semanas. f Imágenes histológicas representativas de la FC teñidas con hematoxilina y eosina. Las barras de escala son de 20 µm. g Cuantificación de células totales/área capsular +/− IA en el día 3, día 5 y 2 semanas. h Reconstrucciones topográficas representativas de imágenes de µCT que muestran las diferencias en el grosor de FC+/− IA a las 2 semanas. i Espesor promedio de FC de los grupos de control y activados en el día 3, día 5, 2 semanas y 8 semanas con dos mediciones por animal. j Imágenes representativas de microscopía de luz polarizada de la FC obtenidas después de la tinción con rojo picrosirius a las 8 semanas. Las barras de escala son de 100 µm. k, Cuantificación de la orientación de las fibras de colágeno FC por coherencia óptica con 60 ROI por animal. l Imágenes SEM representativas que demuestran una invasión celular reducida con activación en el punto de tiempo de 8 semanas. Las barras de escala son de 500 µm. n = 2–6 animales por grupo; los datos son medias ± error estándar de la media; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Consulte la Nota complementaria 1 para obtener análisis estadísticos detallados.

Primero, investigamos la fase aguda inicial de la FBR inflamatoria. Mediante tinción inmunofluorescente con Ly-6G+, examinamos la región pericapsular en busca de neutrófilos, los primeros en responder a la defensa inmunitaria. Encontramos que IA reduce significativamente la presencia de neutrófilos en el día 5 en comparación con el control (Fig. 4b, c). Este resultado indica que la aplicación de IA puede mediar un efecto inmunomodulador localizado.

A continuación, evaluamos la activación de las células productoras de matriz en un fenotipo de miofibroblastos, una célula contráctil clave en la progresión de la fibrosis. El grupo IA exhibió una reducción significativa en la expresión de αSMA en comparación con el control a las 2 semanas (Fig. 4d, e). A pesar de observar diferencias en las poblaciones de células individuales (neutrófilos, miofibroblastos), no detectamos diferencias en el número total de células en puntos de tiempo equivalentes (Fig. 4f, g).

A continuación, investigamos los cambios capsulares a macroescala responsables de mejorar el transporte de la terapia. Examinamos el grosor de la cápsula en evolución con períodos más largos de implantación de STAR. IA mitigó el crecimiento de la cápsula en las primeras 2 semanas posteriores a la implantación, observándose una reducción significativa en el grosor con respecto al control a las 2 semanas (Fig. 4h, i). Este resultado se alinea con la mayor capacidad de respuesta de la glucosa en sangre del grupo IA en puntos de tiempo tempranos (Fig. 3) y sugiere que el espesor de FC es un contribuyente importante a las mejoras iniciales en el transporte macromolecular.

Sin embargo, a las 8 semanas, el grosor de la cápsula se había igualado entre los grupos IA y de control (Fig. 4i). Este resultado sugiere que los mecanismos adicionales son responsables de la mejora sostenida en la respuesta funcional a la insulina en el grupo IA en puntos de tiempo posteriores (Fig. 3). Para investigar esto más a fondo, examinamos la vascularización de la cápsula, la densidad y la madurez de las fibras de colágeno. Sin embargo, no observamos diferencias que explicarían las mejoras en el transporte macromolecular y el efecto funcional (Figura complementaria 7, Nota complementaria 1). Mediante análisis de coherencia óptica de imágenes de microscopía de luz polarizada, encontramos que las fibras de colágeno exhibieron una mayor alineación en el grupo IA en comparación con el control en la semana 8 (Fig. 4j, k). IA pareció aumentar la alineación del colágeno con el tiempo de 2 semanas a 8 semanas, mientras que no se observó ningún cambio temporal en la alineación en el grupo de control (Fig. 4k). Postulamos que el menor grado de alineación y, por lo tanto, el mayor grado de enredo de fibras en el grupo de control crea un impedimento estérico que potencialmente ralentiza o inmoviliza el transporte de macromoléculas a través de la matriz de colágeno55,56.

Finalmente, examinamos la capacidad de IA para proteger contra la invasión celular y el bloqueo de la membrana porosa de STAR. La microscopía electrónica de barrido demostró diferencias claras en la infiltración celular entre el grupo de control y el grupo IA en el punto de tiempo de 8 semanas (Fig. 4l). Este efecto podría atribuirse al flujo convectivo generado por STAR al activarse (Fig. 3g complementaria). Estos análisis capsulares revelan el papel pleiotrópico de IA en la modulación de la FBR y destacan los cambios celulares y estructurales que conducen a un mejor transporte de la terapia macromolecular.

Además de la actuación inmunomoduladora intermitente, demostramos otro mecanismo basado en la actuación robótica suave para aumentar el transporte de fármacos. La RR mediada por activación de un dispositivo STAR cargado con fármaco consta de unos pocos (~1 a 5) ciclos de activación a pedido de la misma magnitud que IA (2 psi, 1 Hz). Esta estrategia puede acelerar el transporte masivo de fármacos desde el reservorio del dispositivo (Fig. 5a, Película complementaria 2) al tejido circundante (Fig. 5b, Película complementaria 3). Usando este enfoque basado en el flujo convectivo bajo demanda, investigamos si RR podría superar una barrera de FC que limita la difusión al inducir mayores gradientes de concentración y presión (Fig. 5c, d).

un RR permite el flujo convectivo de un fármaco modelo, azul de metileno, desde el depósito de terapia de STAR. La barra de escala es de 5 mm. b Imágenes fotoacústicas que muestran STAR implantado por vía subcutánea en un modelo de rata: RR permite el flujo convectivo del análogo del fármaco (rojo) desde el reservorio de terapia hacia la bolsa de tejido circundante. c Esquema que muestra el RR mediado por actuación superando la encapsulación fibrosa. d Instantáneas de la simulación COMSOL Multiphysics que muestran la barrera de difusión limitante de la velocidad creada por un FC y la capacidad de mejorar el transporte usando RR. e Concentración de fármaco fuera de la FC comparando la difusión pasiva sola con la RR a los 200 s. f Concentración de fármaco fuera de la FC para una FC delgada (100 μm) o gruesa (200 μm) con 1 o 5 ciclos de activación de RR. g Imágenes in vivo de un modelo de rata con dos dispositivos STAR implantados. La fluorescencia muestra la distribución del análogo de fármaco Genhance 750. La flecha roja indica el dispositivo después de someterse a la activación de RR. h Evolución temporal del área de difusión del fármaco de Genhance 750 en STAR pasiva (control) y activada por RR, cuantificada mediante imágenes fluorescentes IVIS. i Respuesta de glucosa en sangre a la insulina en control (solo difusión pasiva) y en dispositivos STAR activados por RR (en t = 150 min), a las 2 semanas después de la implantación. n = 4 animales por grupo; los datos representan medias ± error estándar de la media. Valor de p calculado a partir de la prueba t de una cola pareada.

Primero, desarrollamos un modelo computacional multifísico que compara el transporte basado en difusión pasiva con RR (Fig. 5d-f). RR mejora el transporte de fármacos a través de la cápsula y, por lo tanto, las concentraciones más altas pueden alcanzar el objetivo terapéutico de manera controlada temporalmente (Fig. 5d, e). Además, los ciclos de activación múltiples pueden aumentar el transporte transcapsular en comparación con un solo ciclo y, por lo tanto, la dosificación se puede adaptar al escenario clínico específico (Fig. 5f). Los cálculos del número de Péclet (Pe)57 estiman Pe = 2,35 para la difusión pasiva y Pe = 70,18 para la RR mediada por actuación, lo que sugiere que para una dosis determinada de fármaco, el tiempo necesario para la administración pasiva del fármaco a través de un proceso dominado por difusión supera con creces el de la actuación- administración de fármacos mediada, que está dominada por convección.

Para corroborar estas simulaciones, a continuación investigamos la utilidad de RR in vivo, luego de la implantación y el desarrollo a largo plazo de un FC. Implantamos dos dispositivos STAR en un modelo de rata Sprague Dawley para evaluar la distribución espacial del fármaco con y sin RR. El día 24 después de la implantación, monitoreamos el área de distribución de un análogo de fármaco de molécula pequeña fluorescente (Genhance 750) utilizando un sistema de imágenes in vivo (IVIS) (Fig. 5g). Si bien la difusión pasiva de Genhance fue lenta, RR condujo a un fuerte aumento (~ 7 veces) en la distribución del fármaco, a pesar de la presencia de un FC (Fig. 5h).

En un ejemplo final, demostramos un transporte de masa mejorado y un efecto funcional aguas abajo usando RR en nuestro modelo ITT a las 2 semanas después de la implantación de STAR (Fig. 5i). La difusión pasiva de insulina condujo a una caída de la glucosa en sangre durante 120 min en todos los animales. En este punto, se le dio comida a un grupo para permitir la recuperación de los niveles de glucosa en sangre hacia la línea de base. A los 150 min, este grupo fue sometido a 5 ciclos de actuación (con los mismos parámetros de 2 psi a 1 Hz). No se administró insulina adicional después de la dosis inicial administrada al comienzo de la ITT. A pesar de un gradiente de concentración de insulina reducido en todo el dispositivo y una sensibilidad a la insulina atenuada en los animales posprandiales, la RR mediada por activación condujo a una reducción significativa en los niveles de glucosa en sangre durante 15 minutos debido a la liberación aumentada de insulina de STAR (Fig. 5i).

Estos resultados respaldan el desarrollo de un método basado en la actuación bajo demanda para mejorar el transporte a través de un FC que limita la difusión.

Demostramos en un modelo de cadáver humano que las características suaves y plegables de STAR se prestan a la implantación mínimamente invasiva, lo que establece la viabilidad de la traducción clínica. Nuestra elección de material (TPU) permite la escalabilidad a dimensiones clínicamente relevantes (80 mm × 120 mm) y la integración de elementos adicionales, como canales de despliegue y adhesivos, sin cambiar el proceso de fabricación (Fig. 8 complementaria). Diseñamos un sistema de despliegue y un plan quirúrgico (Fig. 9 complementaria) para permitir la implantación mínimamente invasiva de STAR en un sitio de colocación intermuscular a través de una incisión de 1 cm. El sistema de despliegue consiste en una vaina de entrega, un globo que crea espacio y un cartucho de entrega que contiene STAR. Seleccionamos el plano del transverso del abdomen, que se encuentra en la pared abdominal anterior entre los músculos oblicuo interno y transverso del abdomen, como lugar de implante (Fig. 6a). Este espacio potencial está bien vascularizado y es un plano tisular establecido al que acceden con frecuencia los proveedores de atención médica, por ejemplo, para administrar analgesia durante una cirugía abdominal58,59.

a Ubicación del plano del transverso del abdomen en la pared abdominal anterior. b Acceso con aguja guiada por ecografía al plano intermuscular del tejido deseado en la pared abdominal anterior e hidrodisección para generar un espacio potencial (EOM: músculo oblicuo externo, IOM: músculo oblicuo interno, TAM: músculo transverso del abdomen). c Se utilizó la técnica de Seldinger para acceder con la aguja al plano del transverso del abdomen y se cambió una vaina de 5 Fr por una guía para mantener un acceso duradero al plano del tejido. d Se usa un juego de dilatador disponible comercialmente para expandir el espacio para acomodar el posicionamiento de la vaina de despliegue. e Avance de STAR a través de la vaina hacia el espacio tisular. f, g Se usó un agente de contraste ecogénico para inflar el canal de despliegue para asegurar el despliegue completo del dispositivo STAR dentro del avión usando guía por ultrasonido.

Guiados por imágenes de ultrasonido, primero accedimos al espacio intermuscular transverso del abdomen con una aguja de calibre 18 en la pared abdominal anterior y usamos hidrodisección para separar el plano de tejido entre los músculos oblicuo interno y transverso del abdomen (Fig. 6b). A continuación, utilizamos la técnica de Seldinger para cambiar la aguja por un alambre60 y verificar la colocación correcta del tejido con guía ecográfica (Fig. 6c). Luego hicimos una incisión en la piel de 1 cm para facilitar la colocación del dispositivo y usamos un dilatador disponible en el mercado para expandir el espacio y acomodar el posicionamiento de nuestra vaina de colocación a medida (Fig. 6d). Finalmente, completamos la separación de los planos tisulares con un balón creador de espacio, que se pudo visualizar con ultrasonido durante el llenado. Luego, el dispositivo STAR ampliado se precargó en el cartucho de administración, se hizo avanzar fácilmente a través de la vaina hasta el plano submuscular (Fig. 6e) y se desplegó. La presurización del canal de despliegue con contraste ecogénico permitió la apertura del dispositivo bajo visualización ecográfica (Fig. 6f, g). La disección posterior al procedimiento del tejido indicó que el dispositivo se colocó con éxito en el espacio apropiado.

Presentamos STAR, una plataforma implantable que puede evadir y superar la barrera de difusión de la FC para lograr un transporte de terapia mejorado a largo plazo utilizando dos estrategias robóticas blandas sinérgicas: (1) activación inmunomoduladora intermitente y (2) liberación rápida mediada por activación.

Antes de probar estas estrategias mecanoterapéuticas, desarrollamos un método sólido in vivo (ITT) para detectar el efecto de la FBR en el transporte macromolecular de insulina y monitorear este resultado a lo largo del tiempo (Fig. 2). El ITT tiene varias características ventajosas que ayudan al desarrollo tecnológico. En primer lugar, su medición en tiempo real permite una retroalimentación ágil y un desarrollo iterativo. En segundo lugar, el método permite una evaluación cuantitativa y precisa de la intervención utilizando parámetros clínicamente relevantes que incluyen el tiempo hasta el efecto, el efecto máximo o una integración del tiempo y la magnitud a través del AUC. Finalmente, las mediciones no invasivas repetidas permiten estudios longitudinales de fenómenos multifásicos complejos con la capacidad de rastrear animales individuales y grupos de tratamiento a lo largo del tiempo.

IA es el primer elemento en el arsenal de STAR. Al inducir tensión en la membrana de contacto con el tejido y perturbar el flujo de fluido alrededor del dispositivo, STAR actúa como un escudo mecánico oscilante contra el FBR celular invasor. Estos efectos mecánicos localizados crean un entorno favorable para el transporte a largo plazo de macromoléculas. IA es capaz de preservar el efecto funcional de STAR durante 8 semanas al mismo nivel que se observa inmediatamente después de la implantación, es decir, antes de la formación de un FC inhibidor significativo (Fig. 3c). En marcado contraste, la capacidad de respuesta a la insulina del grupo de control disminuyó con un tiempo de implantación más largo, hasta el aislamiento casi completo de FC y el fracaso del implante. La extensión del efecto terapéutico utilizando un régimen de actuación simple de 5 minutos dos veces al día representa una estrategia atractiva e innovadora para mitigar la FBR.

Al combinar los resultados de glucosa en sangre ITT con una variedad de técnicas analíticas capsulares ex vivo, pudimos desentrañar los efectos temporales multifásicos de la IA en la infiltración celular y la formación de cápsulas. Al examinar la respuesta inflamatoria en los grupos IA y de control, detectamos diferencias significativas en distintas poblaciones celulares en momentos de infiltración máxima esperada, a pesar de que no hubo diferencia en el número total de células pericapsulares (Fig. 4).

Demostramos que IA produce un efecto inmunomodulador localizado al eliminar los neutrófilos del sitio pericapsular (Fig. 4b, c). La infiltración de neutrófilos es un primer paso importante en la FBR, iniciando y propagando el proceso inflamatorio, lo que provoca el reclutamiento posterior de poblaciones celulares que se sabe que desarrollan la FC (p. ej., macrófagos). La modulación temprana de la respuesta de los neutrófilos puede tener importantes consecuencias a largo plazo en la FBR. De hecho, observamos una tendencia hacia un mejor efecto funcional en el grupo 3W IA en comparación con el control incluso después de detener la actuación. Aunque este efecto no alcanzó significación estadística, puede haber algunos beneficios a largo plazo en el transporte de la terapia incluso con períodos iniciales de actuación; sin embargo, está claro que el beneficio antiinflamatorio máximo se logra con la activación continua (Fig. 3f). Un estudio reciente de Seo et al49. corrobora la naturaleza mecanosensible de las poblaciones de células de neutrófilos después de la carga dinámica para la regeneración del músculo esquelético. Los autores postularon que el lavado mecánico de los quimioatrayentes era responsable de la disminución informada de neutrófilos49. En este contexto, nuestro trabajo motiva más estudios sobre el efecto de IA en los gradientes de quimioatrayentes proinflamatorios como la interleucina 1, 6 y 8 en comparación con los efectos mecánicos directos sobre la unión, orientación y función celular.

Notamos una disminución significativa en el número de células de miofibroblastos con IA en comparación con el control (Fig. 4d, e). La activación de las células productoras de matriz en un fenotipo de miofibroblastos, caracterizado por la expresión de αSMA, es un paso crítico en la progresión de la fibrosis. El aumento de la expresión conduce a una mayor actividad contráctil, formación de fibras de estrés y síntesis de matriz extracelular. Además, las células fibrogénicas activadas pueden producir citocinas responsables del reclutamiento de células adicionales y la propagación de la respuesta fibrótica nociva43. Cada vez es más evidente que la rigidez precede o contribuye de manera importante a la fibrosis61. Por lo tanto, reducir la expresión de miofibroblastos y su efecto sobre la rigidez de la matriz puede ser una estrategia clave para modificar este efecto fibrótico que se perpetúa a sí mismo.

Además de los cambios celulares multifásicos con el tiempo, también observamos diferencias multifásicas en la evolución de la arquitectura macrocapsular, con claras diferencias entre los grupos IA y de control. En los puntos de tiempo tempranos (2 semanas) después de la implantación, observamos diferencias en el grosor de la cápsula entre los grupos (Fig. 4h, i), lo que se alinea bien con el transporte mejorado basado en la difusión en estos puntos de tiempo (Fig. 3b, f). El grosor de FC se iguala entre los grupos después de 8 semanas de implantación, lo que indica que otros mecanismos son responsables de la mejora del transporte en puntos de tiempo posteriores. Rechazamos varias hipótesis relevantes para mejorar el transporte en el grupo IA, incluida la vascularización, la densidad de la cápsula y la madurez del colágeno (Fig. 7 complementaria). Sin embargo, notamos diferencias en la arquitectura del colágeno y la infiltración celular en el reservorio del dispositivo, lo que puede contribuir a las diferencias tardías en el transporte y los efectos funcionales entre los grupos (Fig. 4j-l). Serán necesarios más estudios para dilucidar y comprender completamente los múltiples mecanismos en juego. Tenga en cuenta que 2 de los 6 ratones en el grupo de control tuvieron que retirarse del estudio en puntos de tiempo posteriores debido al daño autoinfligido en su tejido dorsal e implante subcutáneo. Curiosamente, esto no ocurrió en ningún grupo de ratones IA. La contractura capsular mediada por FBR excesivo es una condición dolorosa62 que podría racionalizar esta diferencia de grupo, y el trabajo futuro podría investigar más esta observación.

Además de IA, STAR posee una segunda estrategia de aumento de transporte de RR. La activación de un STAR cargado de fármaco puede inducir gradientes de concentración y presión más altos31,32 y, por lo tanto, mejorar el transporte del fármaco a través de un FC formado con control temporal (Fig. 5). La RR puede ser particularmente ventajosa para fármacos potentes en los que la dosificación precisa y el tiempo rápido para lograr el efecto funcional son importantes, o macrofármacos como las proteínas, en los que el flujo convectivo mejora el flujo basado en la difusión, principalmente regido por el peso molecular y el gradiente de concentración33,34. La administración mejorada por convección se ha utilizado con éxito para mejorar la distribución de la quimioterapia en objetivos de tumores cerebrales profundos, aunque con resultados clínicos modestos26,27,32,63.

Prevemos varios escenarios de uso clínico para las tecnologías IA y RR demostradas en este trabajo. La RR podría usarse independientemente de la IA, por ejemplo, para la administración rápida y bajo demanda de tratamientos en respuesta a una emergencia clínica. Algunos ejemplos relevantes incluyen la administración de adrenalina para el tratamiento de la anafilaxia o glucagón para el tratamiento del coma hipoglucémico. En ambos casos, la impedancia de entrega debido a la formación de FC tendría graves consecuencias.

Una estrategia óptima de mitigación de FC también podría combinar tanto IA como RR. Por ejemplo, breves ráfagas diarias de IA (sin fármaco) podrían atenuar la FBR para prolongar la vida útil del dispositivo y mejorar el rendimiento en la implantación a largo plazo. A continuación, se podría utilizar un régimen de actuación de RR modular y controlado temporalmente para realizar ajustes de dosis rápidos y precisos de acuerdo con el escenario clínico específico del paciente y/o la gravedad de la FBR. IA y RR son estrategias complementarias que hacen uso elegante de un solo diseño de dispositivo y bomba, lo que hace que STAR se adapte bien a una variedad de escenarios clínicos.

El control de la diabetes tipo 1 es un área clínica relevante en la que STAR podría proporcionar un beneficio sinérgico. Por ejemplo, IA podría aplicarse para prolongar la vida útil de un páncreas artificial64, evitando bloqueos innecesarios mediados por FBR, eventos hiperglucémicos relacionados y, en última instancia, simplificando el régimen de dosificación y la experiencia del paciente. En sinergia, la RR mediada por actuación podría hacer ajustes rápidos de insulina y mantener los niveles de glucosa en sangre en la estrecha ventana necesaria para prevenir complicaciones a largo plazo65. Mirando más hacia el futuro, la aplicación de STAR podría permitir la traducción de tecnologías bioartificiales de próxima generación que utilizan células de islotes productoras de insulina derivadas de humanos mediante la modificación de la FC que limita el transporte, que ha sido una barrera importante para la viabilidad de la terapia basada en células18, 66,67,68. Teniendo en cuenta la necesidad de IA diaria para la eficacia a largo plazo, es probable que las realizaciones requieran una bomba portátil, similar a las que se utilizan en las bombas de insulina existentes69.

El material blando de STAR le otorga ventajas de biocompatibilidad sobre los sistemas de administración de fármacos implantables rígidos70 y se presta a la implantación de catéteres mínimamente invasivos. En un paso hacia la traducción clínica, ampliamos el dispositivo STAR y desarrollamos una herramienta de administración personalizada, así como un procedimiento mínimamente invasivo que es congruente con las técnicas convencionales de radiología intervencionista (Fig. 6). Demostramos la entrega de STAR a un espacio intermuscular clínicamente accesible en la pared abdominal anterior en un modelo de cadáver humano. Este enfoque permitió un tiempo de procedimiento corto (<20 min) para la implantación de un dispositivo a escala humana a través de una vaina modificada utilizando la guía de ultrasonido en manos de un radiólogo intervencionista experimentado. Las características de diseño adicionales demostraron el despliegue correcto y la entrega del adhesivo para mantener la posición del dispositivo en el plano del tejido. Por lo tanto, STAR puede ser implantado rápidamente por intervencionistas en un entorno ambulatorio bajo anestesia local utilizando una modalidad de imagen establecida.

Aunque hemos demostrado resultados preclínicos sólidos en un modelo de ratón a largo plazo, existen varias limitaciones y barreras para la traducción clínica. Nuestros hallazgos de la implantación en el espacio subcutáneo dorsal de ratones pueden no predecir directamente resultados similares en humanos en diferentes ubicaciones anatómicas (p. ej., espacio intermuscular abdominal), y se necesita más trabajo para comprender cómo estas diferencias anatómicas y microambientales afectan los efectos de STAR. Aunque los modelos de roedores se han utilizado ampliamente para estudiar el FBR9,26, se ha demostrado que los roedores tienen un contenido de colágeno tisular diferente en el espacio subcutáneo que rodea un implante y diferentes metabolitos en el líquido intersticial en las interfaces del implante, en comparación con los humanos71. Además, las diferencias en la piel, el pelaje y los comportamientos de los roedores pueden someter a los dispositivos implantados a fuerzas biomecánicas diferentes a las de los humanos51. Alentadoramente, hasta ahora, hemos observado efectos mitigadores de FBR similares con un régimen IA que es independiente de la especie y el diseño del dispositivo34. Además de esto, la presencia de vías inflamatorias conservadas en la formación de FC entre especies72 sugiere que STAR puede tener un beneficio similar en la prolongación de la vida útil del implante en humanos.

Aunque ha habido una serie de estudios previos que examinan el efecto de la carga mecánica sobre la inflamación y la regeneración de tejidos, existe una heterogeneidad significativa con respecto a los métodos de actuación, los regímenes, las deformaciones resultantes, los tejidos diana y los modelos animales utilizados44,45,46,47 ,48,49,50. Solo unos pocos estudios han intentado abordar el efecto de la variación de la tensión tisular47,49,50 y la frecuencia de carga50; por lo tanto, se necesita un trabajo significativo para definir los parámetros de carga óptimos que maximicen los efectos antiinflamatorios de la activación mecánica, que pueden diferir según el tipo de tejido y el estímulo mecánico.

Podemos sacar seis conclusiones de este estudio: (1) El ITT representa un método longitudinal robusto para monitorear el transporte de la terapia macromolecular a través de un FC en desarrollo in vivo. (2) El FBR puede negar el transporte de insulina con el tiempo desde un dispositivo STAR estático hasta el aislamiento completo del implante y el fracaso de la terapia. (3) La actuación intermitente puede preservar el transporte de la terapia a los niveles iniciales y prolongar la vida útil terapéutica de STAR, incluso con una implantación a largo plazo. (4) IA puede mediar cambios inmunomoduladores en la respuesta inflamatoria de los neutrófilos y provocar cambios temporales multifásicos aguas abajo en la infiltración celular y la formación de cápsulas. (5) La RR mediada por activación de un dispositivo STAR cargado con fármaco puede mejorar de manera sinérgica el transporte masivo y el efecto terapéutico con un control temporal ajustable, a pesar de la presencia de un FC. (6) La implantación del catéter mínimamente invasivo de STAR fue posible en un modelo de cadáver humano, lo que demuestra la traducibilidad clínica de nuestro enfoque.

En resumen, la plataforma STAR representa un nuevo enfoque mecanoterapéutico para mitigar y superar la FBR, extendiendo la vida útil y la eficacia de los dispositivos implantables de administración de fármacos. Tiene una gran utilidad clínica para una variedad de indicaciones en las que el transporte se ve afectado por la fibrosis, como el tratamiento de la diabetes tipo 1.

Los moldes negativos correspondientes y positivos de uno y dos canales se imprimieron en 3D con resina VeroBlue (Stratasys Objet30) (Figura complementaria 2a). El uretano termoplástico (TPU; 0,3 mm, XGD0385, QING GEN) se termoformó al vacío (Yescom Dental) sobre el molde positivo de dos canales (Figura complementaria 2b). Luego, este proceso se repitió con el canal positivo usando un TPU más delgado (0,076 mm, HTM-8001-M, poliéter, American Polyfilm) (Fig. 2b complementaria). Se cortaron con láser poros de 10 µm de diámetro en una membrana de TPU (0,076 mm, HTM-8001-M, poliéter, American Polyfilm) utilizando un láser UV de nanosegundos (Centro Nacional de Aplicaciones Láser, Universidad Nacional de Irlanda Galway).

Las membranas termoformadas y cortadas con láser se ensamblaron en un molde negativo (Figura complementaria 2c). Se insertaron mandriles de 0,21 mm de diámetro exterior en los canales para mantener la permeabilidad. El ensamblaje se selló con calor usando una máquina de transferencia de calor (330QXAi, PowerPress). Se retiró el mandril y se insertó un tubo de catéter de TPU (0,037″ × 0,023″; MRE037, Micro-Renathane, Braintree Scientific) y se selló con calor al dispositivo usando un tubo termorretráctil. Los dispositivos ensamblados finales medían 15 mm (ancho) × 18 mm (largo) × 2 mm (alto) y constaban de dos cámaras: la más grande de 12 × 6 mm y la más pequeña de 3 × 12 mm (Figura complementaria 3a, b) .

Los dispositivos a escala de rata se produjeron como se describió previamente34. Los dispositivos finales midieron 12 mm de longitud con el reservorio hemisférico de 3,9 mm de altura y 3,5 mm de diámetro, con longitudes variables de tubos de catéter de TPU 3Fr.

Se produjeron dispositivos a escala humana que medían 120 × 80 mm como se describió anteriormente (Fig. 8 complementaria)73. Se incluyeron un canal de despliegue y una cámara de activación adicionales para permitir la administración mínimamente invasiva a través de una vaina y la activación dinámica después de la implantación (Fig. 9 complementaria).

Se desarrolló un sistema electroneumático hecho a medida para proporcionar activación al dispositivo implantado, como se describe en la Fig. 6 complementaria. El sistema consistía en una señalización eléctrica preprogramada para controlar las fuentes de energía neumática. Los componentes neumáticos incluían un generador de vacío y presión positiva, un regulador de presión y válvulas electroneumáticas (solenoide). Se utilizó una placa de microcontrolador programable (Arduino Uno) junto con una fuente de alimentación para establecer un control de lazo abierto de la potencia neumática. La presión positiva se guió a través de un regulador de presión electroneumático (ITV1030; SMC Inc.) que se controló a través de la placa del microcontrolador para ajustar la presión de actuación precisa. A continuación, se logró la actuación del dispositivo implantado alternando la presión positiva para la expansión del dispositivo y la presión negativa para el desinflado del dispositivo. La entrega de este patrón de actuación neumática estuvo asegurada por dos válvulas de solenoide electroneumáticas (NVKF333; SMC Inc.) para presión positiva y negativa que se controlaron usando el mismo microcontrolador y dos MOSFET acoplados a la fuente de alimentación eléctrica (Suplementario Fig. 6a). Se usó un colector para accionar varios dispositivos en animales separados simultáneamente, asegurando que el nivel de presión establecido se alcanzara de manera consistente en todos los canales del colector (Fig. 6b, c complementarias).

Los dispositivos STAR se fabricaron y colocaron en un soporte impreso en 3D hecho a medida (Objet30 Prime, Stratasys). Los dispositivos se inflaron neumáticamente de 1 a 9 psi utilizando el sistema de control y accionamiento electroneumático descrito anteriormente. Las imágenes de la desviación de la membrana se capturaron utilizando una cámara digital (Nikon DLSR) y un trípode colocado en la vista lateral. La magnitud de la deflexión se analizó posteriormente utilizando ImageJ. Sobre la base de esta estrategia, se seleccionó una configuración de dos cámaras para investigar el efecto de dos magnitudes de deflexión distintas (0,58 y 1,3 mm) en nuestro modelo de ratón preclínico. Cabe señalar que la magnitud de deflexión más baja coincidía estrechamente con nuestro trabajo anterior.

Se caracterizaron piezas de 5 mm × 5 mm de membranas de TPU porosas cortadas con láser mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) utilizando un microscopio Hitachi S2400 que opera a un potencial de aceleración de electrones de 20 kV en modo de imagen de electrones de retrodispersión y una distancia de trabajo de muestra entre 8 y 10 mm. Después de la obtención de imágenes, se midieron los diámetros de los poros a partir de las imágenes utilizando la función de transformación del círculo de Hough en Fiji 2.0.0 (ImageJ) (Fig. 1 complementaria).

Se realizaron simulaciones de interacción fluido-estructura (FSI) utilizando el método hidrodinámico de partículas suavizadas (SPH) para investigar el flujo de fluido periimplantario y la dinámica del transporte de fármacos bajo administración activa. Todas las simulaciones de FSI se crearon con Abaqus/Explicit 2018 (Dassault Systèmes, Vélizy-Villacoublay, Francia). El dispositivo se modeló como una geometría de superficie 3D y se enredó con 14 636 elementos de capa de cuatro nodos (nodo Abaqus tipo S4R). Se aplicó una condición de contorno de Dirichlet, donde el desplazamiento nodal en todas las direcciones se fijó en cero, en el borde de la membrana porosa inferior para evitar el movimiento del cuerpo rígido. Se aplicó una carga de presión que aumentó linealmente hasta 2 psi en 500 ms y disminuyó a 0 psi en los siguientes 500 ms a la superficie interna de las membranas exterior y media. Las membranas se modelaron utilizando un material hiperelástico de tercer orden de Ogden con parámetros μ1 = -8,31 MPa, μ2 = -0,36 MPa, μ3 = 17,89 MPa, α1 = 0,46, α2 = 3,62, α3 = -3,10. Los dominios fluidos, el fármaco y el fluido exterior, se combinaron con elementos tetraédricos lineales y cada elemento se convirtió en una partícula SPH ubicada en su centroide. El dominio del fármaco y el dominio del fluido externo contenían 107 406 y 174 516 partículas, respectivamente. A las partículas se les asignaron las siguientes propiedades: densidad de 9,96E-7 kg/mm3, módulo aparente de 2,094 GPa y viscosidad dinámica de 3,56E-8 MPa–s.

Se construyó un modelo estructural de elementos finitos (FE) para investigar la deformación del tejido debajo del dispositivo. El dispositivo se modeló con la misma geometría y modelo de material que las simulaciones FSI. Para modelar la restricción de la piel cuando el dispositivo se implanta por vía subcutánea, se agregó una estructura de cubierta en forma de domo con una propiedad elástica lineal (E = 1 MPa) en la parte superior del dispositivo. El tejido también se modeló como un material elástico lineal (E = 15 kPa). En términos de condiciones de contorno, el borde de la piel y la cara inferior del tejido se fijaron en todas las direcciones. Se usaron restricciones de amarre para modelar las uniones de sutura entre el dispositivo y el tejido. Se aplicó un contacto general con coeficiente de fricción de 0,5 en todo el modelo. La cámara interior del dispositivo se sometió a diferentes cargas de presión que aumentaban linealmente (1 psi, 2 psi y 3 psi). De las simulaciones FE, se extrajeron gráficos de contorno de tensión y gráficos de contorno de desplazamiento hacia abajo del tejido. La deformación y la deflexión promedio se calcularon en la interfaz entre el dispositivo y el tejido.

Las simulaciones de transporte masivo se realizaron utilizando el software COMSOL Multiphysics versión 5.6 (COMSOL, Burlington, MA). El modelo 2D contiene tres dominios: el reservorio de fármaco, el FC y el dominio de líquido externo que representa el cuerpo. La FC es una capa delgada que rodea el dispositivo con un grosor que oscila entre 50 μm y 200 μm. El dominio fluido exterior es una región rectangular con una altura y un ancho de 5 mm y 20 mm, respectivamente. El transporte de masa se modeló utilizando la ecuación de difusión-convección transitoria en el módulo 'Transporte de especies diluidas' en COMSOL. La difusividad en el reservorio y el dominio del fluido exterior fue de 855 μm2/s y la difusividad en el FC fue de 50 μm2/s74. Se aplicó una concentración inicial de 1 mol/mm3 en el dominio del depósito del fármaco. La velocidad del fluido entre el dominio del fluido puro y los medios porosos se calculó utilizando las ecuaciones de Brinkman en COMSOL. El depósito de fármaco y el fluido exterior se modelaron como un dominio de fluido puro con una densidad de 997 kg/m3 y una viscosidad de 8,9E-4 Pa–s. El FC se modeló como medio poroso con permeabilidad de 8,9E-16 m2 y porosidad de 0,8. Se aplicó una entrada de presión de 2 psi aumentada y disminuida en 1 s en el límite del depósito cuando se activó el dispositivo; y se aplicó una presión de salida cero en el límite del dominio de fluido exterior. El modelo mostró los cambios transitorios del perfil de distribución del fármaco dentro de los 30 min bajo difusión y convección. En todas las simulaciones, tanto la concentración local como la concentración acumulada regionalmente se extrajeron a lo largo del tiempo como resultados cuantitativos.

El número de Péclet para la transferencia de masa, para una longitud característica L, se define como PeL = uL/D, donde u es la velocidad del flujo local y D es la difusividad57. Para cálculos representativos, se asumió L = 1 mm. Esta suposición se basa en datos experimentales y computacionales que muestran que la desviación máxima de la membrana del dispositivo es de ~1,5 mm y la desviación estimada del tejido es de ~0,73 mm (Fig. 3 complementaria). Se utilizó una difusividad de D = 855 μm2/s, que es el mismo valor utilizado en los modelos COMSOL Multiphysics anteriores74. Para el escenario de difusión pasiva, una estimación razonable de u es la velocidad del líquido intersticial, que se ha informado ampliamente que está en el rango de 0,1 a 2 μm/s75. Se calculó una velocidad de flujo de 0,06 mm/s adyacente a la membrana porosa inmediatamente después de la actuación a partir de las simulaciones COMSOL anteriores.

Los procedimientos con animales fueron revisados ​​y aprobados de acuerdo con las normas éticas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Tecnológico de Massachusetts. Los animales se alojaron en una instalación con ciclo de luz de 12 h de encendido/apagado, a 20-22 °C con una humedad relativa que oscilaba entre el 30 y el 70 %. Los animales se alojaron individualmente con ropa de cama y comida estándar durante la duración del estudio. Todos los dispositivos se esterilizaron con óxido de etileno antes de la implantación.

Ratones C57BL/6 macho (25–30 g) se anestesiaron con isoflurano inhalable (1–3 %). Se administró una dosis única de buprenorfina de liberación sostenida (Bup-SR, 1 mg/kg) por vía subcutánea para controlar el dolor. Se implantó un dispositivo STAR por vía subcutánea en el ratón como se muestra en la Fig. 4 complementaria. Para preparar el sitio quirúrgico, se eliminó el vello de la parte posterior del ratón con una maquinilla y una crema depilatoria tópica, y el sitio se esterilizó con tres lavados de Povidona yodada y etanol al 70%. Se realizaron incisiones dorsales mediales en la base del cuello y a 1 cm de la cola (Fig. 4a complementaria). Se realizó una disección roma en los sitios de incisión y se usó una pinza hemostática curva para tunelizar subcutáneamente desde los sitios superiores a los inferiores. Se conectó un puerto autosellante transcutáneo disponible en los laboratorios Instech (VABM2B/22R22) al extremo dorsal del catéter de terapia y activación de cada dispositivo STAR. Luego, se insertó el dispositivo STAR de 15 × 18 × 2 mm (Fig. 3a, b complementaria) debajo de la piel a través del sitio de la incisión superior y se hizo un túnel hacia abajo hasta su posición. El dispositivo se aseguró a la fascia subyacente con una sutura a cada lado (monofilamento 7-0). Luego, el puerto se insertó debajo de la piel en el sitio de la incisión superior (Figura complementaria 4b). Luego, la piel en cada sitio de incisión se cerró con suturas interrumpidas (monofilamento Maxon 5-0) (Fig. 4c complementaria), y se permitió que el animal se recuperara en una almohadilla calentada. Para reponer las pérdidas intraoperatorias de líquidos, se administraron 0,2 ml de solución salina tibia por vía subcutánea.

Se midió una medida cinética de la liberación de insulina de los dispositivos STAR y el efecto subsiguiente sobre los niveles de glucosa en sangre a través de un ITT. Se pesó el ratón y se preparó una solución que contenía una dosis de 1 UI/kg/150 µl a partir de una solución madre de insulina humana de acción corta Humulin R U-100. Los animales se mantuvieron en ayunas durante 4 h antes del inicio de la ITT y se mantuvieron en una jaula limpia sin comida ni ropa de cama durante la prueba. Se tomó una medición inicial de glucosa en sangre para establecer una línea de base. A continuación, se administró una preparación de insulina a una dosis total de 2 UI/kg en el dispositivo a través del puerto autosellante transcutáneo disponible en los laboratorios Instech (VABM2B/22R22) en el tiempo = 0 min. Se usó un PNP3M conectado a una jeringa desechable Luer Lock (BD) de 1 ml para administrar la dosis (Fig. 4e complementaria). Después de la administración, se tomaron muestras de sangre de la vena lateral de la cola del ratón y se realizaron mediciones de glucosa en sangre en serie durante 120 minutos usando un sistema de monitoreo de glucosa en sangre Bayer Contour Next en el tiempo = 15, 30, 45, 60, 75, 90 y 120 mín. El animal fue inmovilizado utilizando un inmovilizador comercial (TV-RED 150-STD, Braintree Scientific). La cola se calentó con un calentador HotHand durante 10 s antes de la toma de muestras de sangre. Luego se desinfectó el área con un Kimwipe empapado en etanol al 70%. Finalmente, se realizó la venopunción con una aguja de calibre 27 (BD) y se registró la medición.

La activación intermitente se realizó conectando un sistema de control y activación electroneumático hecho a medida (descrito anteriormente) al puerto de activación transcutánea autosellante mediante un conector PNP3M (Instech) (Fig. 4d complementaria). Luego, el dispositivo se accionó cíclicamente a una presión de entrada controlada de 2 psi a 1 Hz durante 5 min cada 12 h como se describió anteriormente34,46. No había fármaco presente en el dispositivo durante la IA durante todo el estudio.

Los dispositivos se implantaron en ratones C57BL/6 macho como se describe anteriormente. Se realizaron ITT como se describe anteriormente en todos los ratones a las 2, 3, 4, 5 y 8 semanas después de la implantación del dispositivo, después de lo cual los animales fueron sacrificados con CO2. Seis dispositivos eran controles estáticos y diez dispositivos se activaron dinámicamente durante 5 min cada 12 h. El grupo de actuación se dividió 3 semanas después de la actuación, con un grupo (n = 5) que detuvo la actuación y permaneció pasivo a partir de entonces, y otro grupo (n = 5) continuó con la actuación dinámica durante todo el período de estudio de 8 semanas (Fig. 3a ).

Dos semanas después de la implantación, se realizaron mediciones de glucosa en sangre en serie durante 120 minutos después de la inyección de insulina como se describe anteriormente. Se administró alimento al grupo RR a los 120 min para permitir la recuperación de los niveles de glucosa en sangre. A continuación, se realizó la RR mediada por activación accionando el dispositivo STAR a los 150 min. Tenga en cuenta que no se administró insulina adicional después de la dosis inicial administrada en el tiempo = 0 min. El depósito de activación STAR se conectó a una unidad de control neumático hecha a la medida, a través del puerto de acceso autosellante transcutáneo, utilizando un conector PNP3M (Instech) y se activó neumáticamente durante 5 ciclos de 2 psi de presión cíclica a 1 Hz. La duración de la activación y la evacuación fueron equivalentes. Los niveles de glucosa en sangre se midieron mediante muestreo de la vena de la cola en cuatro incrementos adicionales de 15 min en 4 ratones por grupo.

Dos ratas Sprague Dawley hembra (250-300 g) se anestesiaron con isoflurano inhalable (1-3%). Se administró Bup-SR (1 mg/kg) por vía subcutánea para controlar el dolor. Para preparar el sitio quirúrgico, se eliminó el pelo de la espalda de las ratas y los sitios se esterilizaron con tres lavados de Betadine y etanol al 70%. Se hizo una incisión superior en la base del cuello para el puerto, y se hicieron dos incisiones inferiores a 9 cm de la incisión original a lo largo de la espalda de la rata ya 1 cm lateral de la columna vertebral. Se hizo una disección roma en todas las incisiones y se usó un par de fórceps para tunelizar subcutáneamente desde el sitio anterior al posterior. Se conectó un puerto autosellante transcutáneo disponible en los laboratorios Instech (VABM2B/22R22) al extremo dorsal del catéter de terapia y activación de cada dispositivo STAR. Los puertos se colocaron en posición en la base del cuello y los dispositivos se tunelizaron posteriormente en su posición. Cada puerto se aseguró a la fascia subyacente usando al menos una sutura interrumpida (monofilamento 5-0). Cada dispositivo STAR se aseguró a la fascia subyacente con una sutura a cada lado (monofilamento 7-0). La piel se cerró con suturas discontinuas (monofilamento 5-0), y luego se dejó que el animal se recuperara sobre una almohadilla caliente. Se administró solución salina tibia (300 µL) por vía subcutánea para mitigar la pérdida de líquidos y la deshidratación causada por la cirugía. Los animales fueron sacrificados por CO2.

El día 24 del estudio preclínico en ratas, se evaluó la liberación de un análogo de fármaco fluorescente de molécula pequeña, Genhance 750 (Perkin Elmer), mediante el sistema de imágenes in vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer). Se utilizó un filtro de excitación de 745 nm y un filtro de emisión de 800 nm para adquirir las imágenes. Primero, los animales fueron anestesiados usando isoflurano inhalable. Se eliminó el vello por encima del reservorio STAR subcutáneo y se marcó la circunferencia de cada reservorio en la piel para ayudar a identificar la región de interés (ROI). Después de la preparación, se adquirió una imagen de control. A continuación, se inyectaron 35 μl del análogo de fármaco Genhance a través del puerto transcutáneo y la línea de recarga en cada depósito STAR utilizando una bomba de jeringa (aparato de Harvard). Primero se limpiaron la línea de llenado y el depósito aplicando presión negativa. Las imágenes se adquirieron cada 3 min en una secuencia. Después de 14 minutos después de la inyección de Genhance en STAR, se detuvo la obtención de imágenes y se activó neumáticamente el depósito de intervención. A continuación, se reiniciaron las imágenes. Usando un umbral de imagen consistente, se usó un ROI personalizado para delinear el área de difusión en cada imagen (Living Image 4.5.4, PerkinElmer). El área inicial de difusión en t = 0 después de la inyección se sustrajo de todas las lecturas posteriores para el análisis.

Se cargó solución de azul de metileno (1 mg/mL) en el reservorio STAR y se llenó de agua la línea de actuación del dispositivo mediante una válvula de tres vías (Qosina), ya que el aire podría interferir con la señal de ultrasonido. El dispositivo se implantó por vía subcutánea en una rata Sprague Dawley justo después de la eutanasia. Las imágenes de ultrasonido y fotoacústicas (PAI) se realizaron con el sistema de imágenes fotoacústicas y micro-ultrasónicas Vevo LAZR-X (FUJIFILM VisualSonics, Toronto, Canadá) con un transductor MX550 a una frecuencia de 40 MHz y una resolución de 40 μm. La estrecha fibra óptica Vevo, compuesta de sílice fundida de alta eficiencia y rodeada por una cubierta de fibra MX550, se utilizó para obtener imágenes PAI multiespectrales.

La sonda se movió a través de la piel y el dispositivo subcutáneo, utilizando un motor paso a paso 3D para obtener un conjunto de datos 3D. Usando el modo Nanostepper, cada porción del escaneo 3D constaba de imágenes tomadas en longitudes de onda de 680, 730, 750, 800, 850 y 900 nm. Además, se realizó una adquisición en modo Spectro en un solo corte, donde se tomaron imágenes entre 680 y 970 nm en incrementos de 5 nm. Las imágenes se renderizaron con el software VevoLAB 3.2.0 (FUJIFILM VisualSonics, Toronto, Canadá).

El protocolo para este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación de la Universidad Nacional de Irlanda Galway (NUI Galway). Todo el material cadavérico fue legado a la Escuela de Medicina, NUI Galway, para un mayor avance del conocimiento médico. Se obtuvo el consentimiento informado de los familiares más cercanos como parte del proceso de legado. Esto está cubierto por la legislación que rige la práctica de la anatomía en la República de Irlanda (Ley de médicos de 2007). Se fijaron cadáveres humanos masculinos adultos completos con líquido de embalsamamiento que contenía metanol al 21 %, glicerina al 21 %, fenol al 5,6 % y formaldehído al 3,1 %. Se utilizó una técnica de Seldinger para acceder al plano del transverso del abdomen bajo control ecográfico60. El sistema de administración constaba de una vaina de administración, un globo que creaba espacio y el cartucho de administración STAR (Figura complementaria 9). La vaina de entrega y el cartucho de entrega STAR se imprimieron directamente en 3D (Form 2, Formlabs, Somerville, MA). El globo creador de espacio consistía en un eje impreso en 3D conectado a un globo de TPU. Se utilizó un transductor de ultrasonido lineal de 4-14 MHz (Clarius) para visualizar las capas musculares de la pared abdominal anterior en el cadáver. Se avanzó una aguja de calibre 18 en el plano del transverso del abdomen y se inyectó solución salina fisiológica para separar los planos musculares con hidrodisección. Se cambió la aguja por una vaina de 5 Fr, 10 cm y se realizó una incisión cutánea de 1 cm con bisturí. Luego se hizo avanzar un alambre Amplatz Super Stiff de 0,035" (Boston Scientific) en el espacio y se realizó la dilatación en serie usando un juego de dilatadores renales tipo Amplatz (Boston Scientific), seguido por el avance de la vaina de liberación hecha a la medida en el plano del tejido. El globo de creación de espacio se usó para separar completamente los planos del tejido y luego se cambió por el cartucho de administración. A continuación, se desplegó STAR utilizando el cartucho en el espacio intermuscular. Se retiraron el cartucho y la vaina de administración y se demostró el llenado del reservorio. con infusión de un agente de contraste ultrasónico (SonoVue) y visualizado bajo ultrasonido.El correcto despliegue y posicionamiento del dispositivo se confirmó con disección.

Después de sacrificar a los animales con CO2, se extrajo cada dispositivo y el tejido circundante inmediato. Los tejidos se fijaron durante 24 h con formalina al 10% (pH 7,4). A continuación, el tejido se lavó y almacenó en PBS. Las muestras de tejido fijadas se cortaron por la mitad, se orientaron y se incluyeron en bloques de cera de parafina para análisis histológicos e inmunohistoquímicos. A cada bloque se le asignó un código con fines de aleatorización y cegamiento. Se cortaron secciones de 7 µm, se desparafinizaron en xileno y se rehidrataron a través de una serie de alcoholes graduados. Para evaluar la disposición y la madurez del colágeno FC, las secciones se tiñeron con Fast Green al 0,1 % y luego con rojo Sirius al 0,1 % en ácido pícrico saturado. Luego, los portaobjetos se deshidrataron a través de alcoholes graduados y se aclararon en dos cambios de xileno. Los portaobjetos se cubrieron con un medio de montaje DPX y se dejaron secar. Se tomaron imágenes de los portaobjetos utilizando el software de imágenes Ocular 2.0 en un microscopio de luz polarizada Olympus BX4 (Mason Technology Ltd. Dublin, Irlanda) con un aumento de 20x.

Para determinar el número total de células por área, las muestras se tiñeron con hematoxilina y eosina siguiendo protocolos ampliamente establecidos76. Ocular 2.0 Imaging Software en un microscopio Olympus (Mason Technology Ltd. Dublin, Irlanda) con un aumento de 40x. Para el análisis inmunohistoquímico, los anticuerpos primarios de CD31 (1:200; Ab182981, Abcam) y αSMA (1:500; ab7817, Abcam) se incubaron durante 1 h a 37 °C. Anticuerpos secundarios de Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón inmunoglobulina G (IgG; 1:200 Thermo Fisher Scientific), Alexa Fluor 594 cabra anti-conejo IgG (1:200; Thermo Fisher Scientific) y Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG (1:200; Thermo Fisher Scientific) se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente, respectivamente. El anticuerpo primario Ly-6G (1:100; Biolegend 127602) se incubó durante 1 h a 37 °C después de la recuperación del antígeno Tris-EDTA (pH 9). Se realizó una solución de bloqueo ratón sobre ratón Ready Probe (Invitrogen, R37621) para bloquear la unión endógena. El anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 cabra anti-rata 488 (1:100; Thermo Fisher Scientific) se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Las secciones se tiñeron con Hoechst y se cubrieron con fluoromount. Los portaobjetos teñidos con inmunofluorescencia se observaron utilizando un microscopio confocal invertido de disco giratorio (CSU22, Yokagawa) combinado con el software Andor iQ 2.3. Para el análisis de los vasos sanguíneos, se incubó CD31 (1:200; Ab182981, Abcam) durante 1 hora a 37 °C después de la recuperación del antígeno con citrato de sodio (pH 7,2). Se aplicó una tinción secundaria y de contraste (hematoxilina) Dako EnVision+ System–HRP (DAB) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se adquirieron cinco campos de visión aleatorios de dos secciones usando microscopía óptica. Las imágenes se recortaron para garantizar que solo se incluyera la cápsula en el análisis. Las secciones se convirtieron en imágenes de 8 bits y los núcleos se umbralizaron manualmente a partir del tejido de fondo. Las partículas se delinearon y analizaron usando el software ImageJ (Fiji versión 2.0.0).

Se adquirieron diez campos de visión aleatorios de dos secciones usando microscopía confocal. La fracción de volumen de células αSMA+ y células Ly-6G+ dentro de la FC se estimó mediante una técnica de conteo estereológico imparcial usando el software ImageJ (Fiji versión 2.0.0). Se utilizó el mismo método estereológico imparcial para contar tanto los miofibroblastos como los neutrófilos. Se superpuso a las imágenes una cuadrícula cuadrada estereológica de compensación aleatoria (10 000 μm2) para proporcionar puntos de prueba. Para calcular la fracción de área, se contaron las intersecciones que caían sobre celdas teñidas positivamente y se expresaron como una proporción del total de intersecciones de cuadrícula dentro del FC. Para estimar el volumen relativo de células de miofibroblastos por FC y evaluar si la presencia de miofibroblastos se vio perturbada por la actuación, la fracción de volumen de células αSMA+ se normalizó a un volumen definido por el grosor de FC multiplicado por unidad de área usando la siguiente ecuación: Volumen relativo de Células αSMA+ (mm3) = (Fracción de volumen de células αSMA+)/Espesor FC (mm) × 1 mm × 1 mm.

La cuantificación de la vascularización de la CF se realizó utilizando una técnica previamente reportada5,77,78. Se utilizó una estrategia de muestreo aleatorio sistémico. De cada sección de tejido, se tomaron diez imágenes no superpuestas de la FC en el área de interés. El número de vasos sanguíneos por área (Na) se calculó utilizando un marco de conteo imparcial (tamaño de cuadrícula = 2000 μm2). Se contó el número de puntos que coincidían con los vasos sanguíneos. A continuación, se calcularon las fracciones de volumen de los vasos sanguíneos expresando la proporción de puntos que golpean los vasos sanguíneos como una fracción del número total de puntos observados en el tejido. Se siguió la regla de la línea prohibida para garantizar que los vasos sanguíneos solo se contaran una vez. La aplicación de esta regla de conteo genera una estimación imparcial del número de vasos sanguíneos por unidad de área (Na = CN × Cpts × A; donde CN es el número acumulativo de vasos sanguíneos contados y Cpts es el número acumulativo de puntos en el área de interés).

La cuantificación del contenido de colágeno se realizó mediante una técnica previamente reportada5,34,79,80,81. En ImageJ, se seleccionaron manualmente seis ROI para cada imagen obtenida mediante microscopía de luz polarizada para capturar completamente todas las fibras de colágeno de las que se tomaron imágenes y minimizar el ruido del artefacto de fondo. Usando el complemento OrientationJ 2.0.5, se calculó la coherencia de cada ROI. Cada muestra de dispositivo generó 60 puntos de datos totales (6 ROI por sección, 10 secciones por muestra) (Fig. 4k).

Después de la obtención de imágenes µCT de los dispositivos implantados, se cuantificó el grosor de la fibra óptica utilizando el software Materialise MIMICS Research 18.0.0.525 y Materialise 3-matic Research 10.0.0.212. Los archivos DICOM generados a partir de exploraciones µCT se importaron a MIMICS y se aplicó una máscara de umbral al campo de visión que permitía identificar visualmente el FC mediante un cambio en la intensidad de la señal superior a la capa de la fascia. La región del umbral se recortó para incluir solo la región de la FC y se realizó una segmentación manual de la FC en la vista sagital. Esto se repitió en cada cinco cortes DICOM, con interpolación entre cortes realizada para enmascarar el FC en las regiones intermedias. Al finalizar el proceso de enmascaramiento, se aisló una sección rectangular del centro de la máscara. Se exportó un archivo STL de esta sección rectangular para el análisis de espesor utilizando 3-matic Research. En 3-matic, se utilizó el asistente de corrección para corregir errores en el archivo STL y se aplicó un factor de suavizado de 0,8, después de lo cual el modelo se volvió a mallar con la función de corrección automática. Se generó un análisis de espesor de pared y los datos se exportaron para análisis estadísticos.

Se midió el grosor de la pared del FC aislado debajo de las cámaras pequeña y grande (Figura complementaria 10a, b), que no demostró diferencia. De manera similar, se tomaron medidas de espesor en los bordes del dispositivo que no diferían significativamente de los valores de espesor debajo de las cámaras del dispositivo (Figura complementaria 10c, d).

La densidad del tejido en la cápsula fibrótica se midió utilizando la función 'Densidad en rectángulo' en Materialise MIMICS Research 18.0.0.525 en escaneos µCT de dispositivos STAR explantados. Se midieron tres medidas de radiodensidad de secciones rectangulares (0,01 mm2) de cápsula fibrótica debajo de cada cámara, en cinco ubicaciones a lo largo del dispositivo STAR. Las mediciones de radiodensidad de fondo se obtuvieron de regiones del escaneo que no eran de muestra y se restaron de la lectura de radiodensidad promedio para el FC debajo de cada cámara.

Después de las imágenes de µCT, los dispositivos con tejido circundante asociado se procesaron para SEM. Las muestras de tejido se recortaron primero del exceso de tejido y se eliminó el cabello para evitar la interacción no deseada con el haz de electrones. Las muestras se deshidrataron primero con alcoholes graduados (70 %, 95 %, 100 %, 100 %) antes de colocarlas en un secador de punto crítico LEICA EM CPD300 durante 3 h. Luego, las muestras secas se montaron en trozos de aluminio con lengüetas adhesivas de carbono y se recubrieron con oro mediante un Quorum Q150R ES plus. Las muestras se observaron y se tomaron imágenes con un aumento de 40x 15 kV en un microscopio electrónico de barrido HITACHI S-26OON.

Se utilizaron pruebas t de dos muestras, de una cola y no apareadas para evaluar las diferencias en los niveles de glucosa en sangre y los espesores de FC entre los grupos. Se utilizaron pruebas t de dos muestras, de dos colas y no apareadas para evaluar las diferencias histológicas, inmunohistoquímicas, vasculares y de radiodensidad entre los grupos de control e IA. Antes de realizar las pruebas t, se verificó la igualdad de varianzas entre los grupos mediante la prueba de Levene. Los análisis se realizaron en OriginPro 2018b (OriginLab Corp.) y se utilizó el mismo software para generar todos los gráficos. Los datos se representan como media ± error estándar de la media. Las diferencias entre grupos se evaluaron a un nivel de significación del 95% (α = 0,05). Se aplicó la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples dividiendo α por m, donde m es el número de comparaciones. p se consideró significativo en p < α/m. Los valores de p exactos para todas las comparaciones estadísticas se presentan en la Nota complementaria 1.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y en la Información complementaria. Los datos están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud.

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WW, STR, RB y GPD agradecen el apoyo de Science Foundation Ireland en virtud de la subvención SFI/12/RC/2278, Advanced Materials and Bioengineering Research (AMBER) Centre, Royal College of Surgeons in Ireland, National University of Ireland Galway y Trinity College Dublín, Irlanda. WW, EBD y ETR reconocen una subvención piloto y de viabilidad del Fondo de Investigación de Diabetes Juvenil (1-PNF-2019-778-SB). NAW y EBD agradecen la financiación de la Beca de Investigación Universitaria de la Sociedad Real de Irlanda de la Fundación de Ciencias (URF\R1\191335). SXW reconoce la financiación de la subvención de capacitación de los Institutos Nacionales de Salud T32 HL007734. STR ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del Acuerdo de Subvención de Acciones Marie Skłodowska-Curie No. 713567. DSM reconoce la financiación de la Beca de Postgrado del Gobierno de Irlanda del Consejo Irlandés de Investigación (GOIPG/2017/927) y una beca Fulbright Premio Enterprise Ireland. EBD y GPD reconocen el proyecto DRIVE que ha recibido financiación del Programa Marco Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del Acuerdo de subvención n.º 645991. ETR reconoce la financiación departamental del Instituto de Ingeniería y Ciencias Médicas y el Departamento de Ingeniería Mecánica del Instituto Tecnológico de Massachusetts y financiación de la subvención NSF EFRI 1935291. Agradecemos al Centro de Microscopía e Imagen (NUI Galway) y a Ciaran Weldon por su ayuda con la imagen SEM. Agradecemos al Dr. Bo Ri Seo por proporcionar el protocolo de tinción para la respuesta inmune de neutrófilos.

Estos autores contribuyeron igualmente: William Whyte, Debkalpa Goswami, Sophie X. Wang.

Instituto de Ingeniería y Ciencias Médicas, Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

William Whyte, Debkalpa Goswami, Sophie X. Wang, Niamh A. Ward, David S. Monahan, Joanne O'Dwyer, Arielle S. Rothman y Ellen T. Roche

Departamento de Cirugía, Centro Médico Beth Israel Deaconess, Boston, MA, EE. UU.

Sofía X. Wang

Departamento de Ingeniería Mecánica, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Yiling Fan y Ellen T. Roche

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Nacional de Irlanda Galway, Galway, Irlanda

Niamh A. Ward, Lesley Trask, Joanne O'Dwyer y Eimear B. Dolan

Instituto de Anatomía y Medicina Regenerativa (REMEDI), Universidad Nacional de Irlanda Galway, Galway, Irlanda

Ruth E. Levey, Rachel Beatty, Scott T. Robinson, Raymond O'Connor, David S. Monahan, Robert Wylie, Daniel A. Domingo-López y Garry P. Duffy

Centro de Investigación de Materiales Avanzados y Bioingeniería (AMBER), Trinity College Dublin, Dublín, Irlanda

Scott T. Robinson y Garry P. Duffy

Departamento de Radiología, Hospital Universitario, Galway, Irlanda

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Programa Harvard-MIT en Ciencias y Tecnología de la Salud, Cambridge, MA, EE. UU.

Keegan L. Mendez, Claudia E. Varela, Markus A. Horvath & Ellen T. Roche

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WW, DG, SXW, GPD, EBD y ETR diseñaron el estudio. WW, DG, SXW, NAW, REL, RB, STR, DS, RO'C., DSM, KLM, CEV, MAH, JO'D y ASR realizaron los experimentos. YF realizó el modelado computacional. WW, DG, SXW, YF, NAW, REL, RB, LT, DAD-L, RW y EBD analizaron y revisaron los datos. WW, DG, SXW, YF, NAW, REL, STR, GPD, EBD y ETR escribieron el documento. Todos los autores revisaron y editaron el artículo.

Correspondencia a Eimear B. Dolan o Ellen T. Roche.

WW, STR, KLM, CEV, GPD, EBD y ETR son inventores de una solicitud de patente pendiente relacionada con el dispositivo que se describe aquí. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a David Grainger y a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Whyte, W., Goswami, D., Wang, SX et al. La actuación dinámica mejora el transporte y extiende la vida útil terapéutica en una plataforma de administración de fármacos implantable. Nat Comun 13, 4496 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32147-w

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Recibido: 08 Agosto 2021

Aceptado: 18 julio 2022

Publicado: 03 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32147-w

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