Los microbiomas orales antiguos respaldan los cambios dietéticos graduales del Neolítico hacia la agricultura

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 6927 (2022) Citar este artículo

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El microbioma humano se ha convertido recientemente en una valiosa fuente de información sobre la vida y la salud del huésped. Hasta la fecha se sabe poco sobre cómo pudo haber evolucionado durante fases clave de nuestra historia, como la transición del Neolítico hacia la agricultura. Aquí arrojamos luz sobre la evolución experimentada por el microbioma oral durante esta transición, comparando a los cazadores-recolectores del Paleolítico con los agricultores del Neolítico y la Edad del Cobre que poblaron una misma área restringida en Italia. Integramos el análisis de 76 microbiomas orales de cálculo dental con la información dietética derivada de la identificación de restos vegetales incrustados. Detectamos una desviación más fuerte de la composición del microbioma de cazadores-recolectores en la última parte del Neolítico, mientras que en menor medida en las primeras fases de la transición. Nuestros hallazgos demuestran que la introducción de la agricultura afectó al microbioma huésped, lo que respalda la hipótesis de una transición gradual dentro de las poblaciones investigadas.

En la última década, varios estudios han identificado el microbioma como un tipo de interfaz entre los humanos y el entorno que los rodea. El microbioma humano puede influir en la salud del huésped a través de varios mecanismos1,2 y, a su vez, está determinado por variables relacionadas con las condiciones de vida del huésped (p. ej., estilo de vida, entorno), más que por la genética del huésped3,4. Desde el comienzo de los análisis metagenómicos del microbioma humano, se ha destacado la existencia de grandes grados de variabilidad en la composición del microbioma intestinal entre diferentes poblaciones de todo el mundo5,6. No obstante, la forma en que estas comunidades microbianas surgieron durante la evolución humana y coevolucionaron con sus anfitriones sigue siendo una pregunta abierta.

Los estudios de ADN antiguo (aDNA) pueden potencialmente permitirnos explicar cómo estas comunidades microbianas complejas evolucionaron con el tiempo para alcanzar su composición actual y, además, pueden proporcionar información sustancial sobre sociedades, culturas y condiciones de vida pasadas7,8. Los investigadores ahora están considerando el estudio del microbioma antiguo a partir de coprolitos (es decir, restos fecales fosilizados) y el cálculo dental como herramientas que podrían contribuir considerablemente a revelar la evolución de las comunidades microbianas asociadas a humanos9,10.

Una de las preguntas pendientes con respecto a la evolución del microbioma humano está relacionada con cómo la transición a la agricultura durante el Neolítico dio forma a la composición y biodiversidad del microbioma oral. Los análisis realizados en poblaciones modernas han detectado cambios en la ecología microbiana oral al comparar sociedades tradicionales o de cazadores-recolectores con comunidades urbanas11,12,13,14. Sin embargo, estudios recientes que se han centrado en la transición a la agricultura en nuestro pasado han mostrado resultados controvertidos. Por ejemplo, los datos preliminares del microbioma oral antiguo sugirieron un cambio en la abundancia de especies bacterianas relacionado con la transición del Neolítico, que no fue replicable en un estudio más reciente sobre la evolución del microbioma oral8,15. Investigaciones adicionales en el sur de Europa encontraron poca variación asociada con la transición, identificando principalmente patrones geográficos de variación del genoma bacteriano16. Hasta la fecha, los estudios sobre el microbioma del Neolítico antiguo se han basado principalmente en pequeños grupos de muestras distribuidas en una amplia área geográfica caracterizada por distintas condiciones ecológicas y estrategias de subsistencia, lo que introduce un posible sesgo geográfico y dietético. De hecho, como se observó para diferentes fuentes de microbiomas, las comunidades microbianas que habitan en la placa dental parecen estar influenciadas por la dieta, la ecología y las condiciones de vida17,18,19. Además, la evidencia arqueológica sugiere que la transición neolítica no fue un evento monolítico, sino que se produjeron diferencias en las estrategias de subsistencia adoptadas entre las comunidades coetáneas20,21,22. Esta evidencia puede explicar por qué, cuando se comparan diferentes comunidades neolíticas caracterizadas por tamaños de muestra pequeños y diferentes condiciones ecológicas, se detectan principalmente patrones geográficos de variación en lugar de cambios culturales16, lo que deja abierta esta pregunta. En consecuencia, prestar atención tanto al trasfondo arqueológico como al contexto ecológico se vuelve fundamental para contextualizar la influencia de la transición agrícola en el microbioma oral.

En Italia, la transición hacia la agricultura se inició alrededor del año 6.200 a. C. en el sureste de la península, en una región conocida actualmente como Apulia, donde poblaciones del Levante llegaron a estas tierras siguiendo rutas migratorias a través del mar Mediterráneo23. Aquí, el cambio de cazador-recolector a subsistencia agraria fue documentado como el primero para Italia, y como uno de los más antiguos en Europa occidental23. Las primeras fases se caracterizaron por unos pocos grupos de familias, organizadas en pequeñas aldeas con un tipo típico de producción cerámica denominada "Loza Impresa"23. Durante los siguientes dos milenios, estas comunidades se extendieron hacia el norte, desarrollando estructuras sociales más complejas y también adaptando su sistema agrario de subsistencia en respuesta a los recursos locales y las condiciones ambientales24. En la última década, esta región ha sido objeto de múltiples investigaciones paleodietéticas y paleoecológicas encaminadas a reconstruir la dinámica de la Neolitización, representando así un caso de estudio perfecto para investigar la relación entre el huésped y el microbioma en el momento de la transición24,25,26 . En general, el período Neolítico en esta área se divide en cuatro fases culturales principales: Temprano (correspondiente a la cultura Impressed Ware), Medio (corresp. a la cultura Passo di Corvo), Medio Final (corresp. a la cultura Serra d'Alto) y Neolítico Tardío ( corresp. cultura Diana)23.

Por lo tanto, el objetivo del presente estudio es abordar preguntas relacionadas con los efectos del cambio dietético neolítico en el microbioma oral, integrando información dietética, cultural y ambiental. Proponemos un enfoque alternativo para investigar la evolución de la composición del microbioma en relación con la transición agrícola, minimizando el posible sesgo geográfico y centrándonos exclusivamente en el centro-sur de Italia como estudio de caso (particularmente en la región de Apulia) y considerando el contexto cultural y dietético de cada comunidad. En primer lugar, analizamos nueve muestras de cazadores-recolectores del paleolítico superior de la cueva de Paglicci (31 000-11 000 a. C.), tanto para describir mejor el microbioma preagrícola como para obtener una referencia regional para comparar con las especificidades neolíticas. Hasta la fecha no se han detectado individuos mesolíticos en esta zona. Para abordar mejor los cambios relacionados con la transición, nos enfocamos en un conjunto de 67 muestras desde el Neolítico (6200–4000 a. C.) hasta los períodos de la Edad del Cobre (3500–2200 a. C.), cruzando las cuatro fases que constituyeron el período Neolítico en este y correspondientes a distintos contextos culturales. Además, para expandir el contenido informativo del cálculo dental antiguo, aplicamos un enfoque integrado que combina datos metagenómicos con análisis microscópicos para obtener información dietética sobre las plantas consumidas. Identificamos dos cambios no descritos previamente en la composición del microbioma de las poblaciones investigadas. La primera modificación se produjo entre las comunidades locales de cazadores-recolectores y los agricultores del Neolítico, mientras que un segundo cambio importante inesperado se identificó en la última parte del período Neolítico. Algunos de los cambios taxonómicos y funcionales probablemente fueron impulsados ​​por cambios en las estrategias de subsistencia.

Recolectamos 79 muestras del centro-sur de Italia (Fig. 1), considerando muestras de cazadores-recolectores del Paleolítico superior (PA), muestras de la Edad del Cobre (CA) posteriores al Neolítico, y cruzando todas las diferentes fases del Neolítico (Datos complementarios 1): Neolítico Temprano (EN), Neolítico Medio (MN), la parte final del Neolítico Medio (FMN) y Neolítico Superior (LN). Setenta y seis (76) de las muestras recolectadas fueron investigadas por sus perfiles metagenómicos. Se produjo una media de 28 millones de lecturas por muestra (Datos complementarios 2). De estos, una media del 12,94 % de las lecturas podría asignarse a Bacteria y Archaea, con solo una pequeña parte a Eukaryote (una media del 0,01 %). Los perfiles de microbiomas antiguos obtenidos se agruparon junto con otros microbiomas orales antiguos publicados y muestras orales modernas (Datos complementarios 3 y Figura complementaria 1). Para confirmar la solidez de nuestros resultados, los corroboramos a través del análisis de Sourcetracker, donde la mayoría de las muestras antiguas (71) mostraron una fuerte adherencia al perfil del microbioma oral (>90 %) (Fig. 2 complementaria). Solo unas pocas muestras mostraron un perfil contaminado y, por lo tanto, se excluyeron de análisis posteriores.

Distribución de sitios arqueológicos muestreados en el centro-sur de la península italiana. El número de muestras por sitio se presenta entre paréntesis. Los datos de origen se proporcionan como archivo de datos de origen. El mapa se generó usando el paquete rnaturaleartch (v 0.1.0) en el software R.

Seleccionamos las especies microbianas más abundantes que mostraron una abundancia relativa superior al 0,02 % en todo el conjunto de datos. Este umbral nos permitió obtener un total de 49 especies, evitando especies de baja abundancia y singletons. En consecuencia, las especies obtenidas se validaron para sus perfiles de desaminación (Datos complementarios 4 y Figura complementaria 3). Se detectó un perfil de desaminación cercano entre todas las muestras, sin que se encontraran diferencias significativas con el tiempo (consulte la Discusión complementaria y las Figs. 4 y 5 complementarias para obtener más información tafonómica).

Realizamos un análisis de red para explorar las similitudes de la muestra, detectando cinco grupos diferentes (C1-5) (Fig. 2a). La subdivisión de grupos se validó mediante PERMANOVA y la prueba ANOSIM en una representación de PCoA, lo que confirma que estaba genuinamente influenciada por la composición del microbioma y no relacionada con otros factores de confusión (es decir, extracción o lote de biblioteca, o recuentos de lectura) (Figuras complementarias 6, 7 y Datos Suplementarios 5a y b). De acuerdo con la clasificación aleatoria de bosques, el período de tiempo se identificó como el factor principal que impulsa estas distinciones de grupos, siendo la ubicación geográfica un factor secundario (Fig. 2b). Por lo tanto, podemos suponer un efecto de mezcla de tiempo y geografía, teniendo el período corológico una influencia ligeramente mayor que la geografía. En realidad, el análisis de asociación entre los grupos y el período (Fig. 2c y Fig. 8 complementaria) indicó que el primer grupo (C1) se asoció significativamente con el período PA, mientras que el segundo (C2) se asoció principalmente a Temprano (EN ) y muestras del Neolítico Medio (MN). El sitio de Palagiano, que pertenece al final del Neolítico Medio (FMN), se asoció tanto al C3 como al C5, lo que sugiere la posibilidad de una subestructura adicional dentro del mismo sitio. Es de destacar que C3 está constituido en su mayoría por muestras pertenecientes a la misma tumba (PT10.x), mientras que C5 está formado por muestras pertenecientes a diferentes entierros encontrados en Palagiano. Finalmente, C4 está significativamente asociado con los períodos Neolítico Tardío (LN) y Edad del Cobre (CA), independientemente de la geografía.

a Análisis de red entre muestras. El grosor de los bordes se basa en sus pesos, que indican similitudes no negativas entre las muestras, mientras que la longitud de los bordes representa la distancia de los nodos en función de la distancia de Aitchison. El color del nodo está definido por el clúster identificado por el análisis de clúster jerárquico, y la coloración del borde negro alrededor del nodo identifica los concentradores. b Resultados del análisis de clasificación aleatoria de bosques, que destacan la importancia del período y la geografía (sitio) como las principales variables que forman la base de las diferencias de conglomerados, mientras que la edad de la muerte (Edad) no es discernible. c Correspondencia del tiempo investigado (es decir, cronología), con el trasfondo cultural (segundo bloque), el sitio arqueológico seleccionado (tercer bloque) y los resultados del análisis de conglomerados (C1-C5) reportados en el panel a. En el bloque "Antecedentes culturales", cada cultura neolítica se define con un color diferente, que destaca su asociación con los sitios arqueológicos (tercer bloque) y con la fase neolítica específica que se informa en los encabezados del bloque "Clusters" (es decir, EN , MD, FMN, LN). En el último bloque (es decir, denominado "Conglomerados"), los números de muestra se informan en el eje x y la anotación de conglomerados en el eje y. El color de cada barra está asociado a los colores de los grupos informados en el panel a. Dentro de cada barra, el porcentaje de muestras que se encuentran dentro de un grupo específico se informa en negrita. Aquí, siguiendo las filas de grupos, podemos apreciar que las muestras de PA caen juntas dentro del primer grupo (C1), mientras que EN y MN en el C2. LN y CA están particularmente presentes en C4, mientras que FMN se divide entre C3 y C5. Los datos de origen se proporcionan como archivo de datos de origen.

Esta evidencia sugiere la existencia de un perfil de microbioma específico asociado con las muestras de cazadores-recolectores de AP y, además, que algunas diferencias son detectables incluso dentro del mismo período Neolítico. En particular, las muestras que pertenecen a los primeros siglos de la transición Neolítica en esta área muestran una composición de microbiomas muy similar entre ellos, y una clara diferenciación con las muestras correspondientes a los periodos LN y CA. Se identificaron cuarenta y dos (42) especies a partir del análisis DESeq2 como distribuidas de manera diferente entre los grupos, y algunas de ellas se encuentran dentro de complejos ecológicos bien conocidos para el microbioma oral27 (Fig. 3a-e, Datos complementarios 6). La mayoría de las especies que pertenecen a un mismo complejo exhiben una tendencia similar, como era de esperar por ser metabólicamente interdependientes y ecológicamente asociadas27. Entre las especies que caracterizan estos complejos, podemos observar dos tendencias taxonómicas principales: una para especies que están poco representadas en las muestras de AP, pero que empiezan a aumentar con el inicio de la transición Neolítica; y una segunda tendencia, en la que las especies que prevalecen más dentro de las muestras de AP tienden a disminuir lentamente con el tiempo, alcanzando sus niveles más bajos en LN y CA. Especies significativas pertenecientes al complejo rojo (Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia y Treponema denticola), naranja (Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae y Prevotella intermedia) y verde (Capnocytophaga endotelialis, Capnocytophaga haemolytica, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena y Eikenella corrodens) es sigue la primera tendencia; por lo tanto, están débilmente presentes en las muestras de AP, y luego gradualmente se vuelven más representados al comienzo del período Neolítico, pero solo al final de este período alcanzan la mayor abundancia. Pophyromonas gingivalis también se asoció positivamente con C4 del análisis de MaAsLin y, por lo tanto, con los períodos LN / CA, mientras que Campylobacter gracilis se asoció con C2 y C4 (Figura 9 complementaria y Datos complementarios 7).

un complejo rojo; b complejo de naranja; c complejo púrpura; d complejo amarillo; e complejo verde. Otras especies orales significativas se informan en la Fig. 10 complementaria. Las muestras (n = 71) están representadas por puntos y están coloreadas de acuerdo con la especie. Los diagramas de caja se definen de la siguiente manera: los valores mínimo, máximo y central representan el cuantil 25, 75 y 50%, respectivamente; la mediana está representada por el cuantil 50%; los bigotes superior e inferior son los valores máximo/mínimo de los datos que se encuentran dentro del rango intercuartílico de 1,5 por encima del percentil 75 o por debajo del percentil 25, respectivamente. Los datos de origen se proporcionan como archivo de datos de origen.

Los taxones de los complejos morado (Actinomyces spp.) y amarillo (Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis y Streptococcus sanguinis) siguieron la segunda tendencia, estando muy presentes durante el período AP y disminuyendo su abundancia a lo largo del tiempo. La única excepción en este sentido del complejo púrpura fue Actinomyces sp. taxón oral 414 (Fig. 3c, gráfico superior). Además, también en este caso, el resultado de MaAsLin confirmó una fuerte asociación negativa para todos los Streptococcus spp citados. con casi todos los grupos del Neolítico y CA (Fig. 9 complementaria), mientras que se encontró una asociación positiva de Actinomyces naeslundii y Actinomyces slackii con el período PA.

Otros miembros del microbioma oral cambiaron significativamente su abundancia a lo largo del tiempo, como Olsenella sp. taxón oral 807, Parvimonas micra, Desulfomicrobium orale y Ottowia sp. taxón oral 894, que parece estar muy extendido entre todas las muestras del Neolítico, mientras que Streptococcus sp. el taxón oral 061, Abiotrophia defectica y Klebsiella pneumonieae se enriquecieron dentro del conjunto de datos de PA (Figura complementaria 10). Olsenella sp. el taxón oral 807 demostró una fuerte conexión con la transición neolítica, ya que MaAsLin destacó una asociación positiva tanto con C2 como con C4 y, por lo tanto, con los dos principales grupos neolíticos, mientras que Desulfomicrobium orale se asoció específicamente con el grupo C4.

Las muestras de las primeras fases del período Neolítico (EN y MN), a pesar de proceder de diferentes sitios arqueológicos, mostraron un perfil taxonómico bastante homogéneo y una composición microbiana que parecía estar en una posición intermedia entre los períodos PA y LN/CA. Por tanto, podemos suponer que la primera fase del Neolítico constituye una especie de "estado de transición" entre los dos extremos de las composiciones del microbioma PA y LN/CA. Se caracterizan por elementos en común con LN y CA, y al mismo tiempo, no parecen estar tan alejados de las composiciones de las muestras de cazadores-recolectores.

Además de la composición taxonómica, también caracterizamos las funciones microbianas para corroborar análisis previos y probar cómo estos cambios pueden reflejarse en un paquete funcional genético microbiano. Detectamos varios ortólogos de KEGG como específicos de cada uno de los grupos basados ​​​​en taxonomía (Fig. 11 complementaria).

Los ortólogos de KEGG que están relacionados con el metabolismo de los carbohidratos (por ejemplo, piruvato, propanoato, ascorbato, aminoazúcar y metabolismo del almidón) se encuentran particularmente enriquecidos en muestras de PA (Fig. 4a). Recientemente se descubrió que estos rasgos están asociados principalmente con la presencia de Streptococcus, que es mayor dentro de este grupo de muestras, y con su capacidad para unirse a las proteínas de amilasa del huésped8,28. Sin embargo, todas las muestras del Neolítico están enriquecidas en otras características distintivas dentro del metabolismo de los carbohidratos, como el metabolismo de la galactosa y el metabolismo del glioxilato/dicarboxilato, así como el aumento en las vías de los glicanos (Fig. 12A complementaria).

Los paneles a y b informan las diferencias en el metabolismo de los carbohidratos y los aminoácidos desde el período PA hasta el CA. El panel c representa un aumento en varios factores de virulencia a lo largo del tiempo según la clasificación de Chen et al.91. Las muestras (n = 71), divididas por períodos, se informan en el eje x y la abundancia relativa en el eje y. Los diagramas de caja se definen de la siguiente manera: los valores mínimo, máximo y central representan el cuantil 25, 75 y 50%, respectivamente; la mediana está representada por el cuantil 50%; los bigotes superior e inferior son los valores máximo/mínimo de los datos que se encuentran dentro del rango intercuartílico de 1,5 por encima del percentil 75 o por debajo del percentil 25, respectivamente. Los datos de origen se proporcionan como archivo de datos de origen.

Múltiples ortólogos significativos que pertenecen a las rutas de aminoácidos parecen aumentar con el tiempo, como la biosíntesis de lisina y la biosíntesis de glicina y cisteína, que alcanzan una mayor abundancia en las muestras de LN y CA (Fig. 4b).

Incluso entre el metabolismo de las vitaminas, encontramos vías significativas que cambiaron con el tiempo, especialmente para las vitaminas B (Figura complementaria 12B). Las diferencias en las enzimas que forman parte de la vía biosintética de la cobalamina (vitamina B12) en las bacterias están presentes tanto en la AP como en las muestras del Neolítico. La cobalto-precorrina-6B (K02191) y la L-treonina quinasa (K16651) están representadas principalmente dentro de las muestras de PA, con una tendencia a disminuir con el tiempo, mientras que la percorrina-6Y C5,15 metiltransferasa (K00595) y la adenosilcobinamida-GDP ribazoltransferasa (K02233 ) aumentan a lo largo de las fases del Neolítico. Las muestras neolíticas, especialmente LN y CA, se enriquecen en el grupo de un carbono por el metabolismo del folato, así como por el metabolismo del ácido lipoico; el ácido lipoico es otra vitamina del complejo B que parece afectar la virulencia y patogenicidad bacteriana29.

Curiosamente, detectamos un incremento general en el factor de virulencia entre nuestra cohorte neolítica (Fig. 4c). Los ortólogos de KEEG involucrados en la motilidad bacteriana, la evasión inmune, la antifagocitosis y las endotoxinas aumentaron gradualmente su abundancia relativa con el tiempo, alcanzando sus niveles más altos en LN y CA. Las especies que contribuyeron al aumento de los niveles de estos factores de virulencia fueron P.gingivalis, T. forsythia, P. intermedia, Capnocytophaga ochracea y Fusobacterium nucleatum.

En general, como se observó en el análisis taxonómico, los sujetos que pertenecían tanto a EN como a MN tenían una composición funcional muy cercana (como se destaca en el análisis de conglomerados exploratorio), que era una especie de posición intermedia entre los dos estados más diferentes observados en PA y Muestras LN-CA.

Las nueve muestras de cálculo dental pertenecientes a las muestras del Paleolítico superior (PA) produjeron principalmente granos de almidón, con respecto a otros tipos de microrrestos detectados, por una cantidad total de 215 granos de almidón individuales (Discusión complementaria y Datos complementarios 8). Los granos de almidón se asociaron principalmente con Poaceae, y en particular con Triticeae silvestre y Avena cf. barbata (avena, cf. avena salvaje delgada). Finalmente, se identificaron morfológicamente granos de almidón particulares como los del rizoma de Nuphar lutea (nenúfar amarillo). También se han encontrado granos de almidón de nenúfares (no nenúfares amarillos) en cálculos dentales neandertales30.

Para los períodos Neolítico y Edad del Cobre, se analizaron 18 muestras (Datos complementarios 8). En general, se recuperaron de las muestras 25 granos de almidón pertenecientes a dos morfotipos. Los granos de morfotipo I mostraron características de diagnóstico para el grano de tipo A de las especies de la tribu Triticeae. Entre los numerosos fitolitos, se recuperaron 16 epidermis dendríticas alargadas. Este tipo de fitolitos en el cálculo dental normalmente se consideran una evidencia directa del consumo de cereales, ya que se producen en las brácteas de las inflorescencias de las especies de trigo y cebada31. Curiosamente, se recuperaron numerosas diatomeas del género Nitzschia, que incluían muchas especies marinas y de agua dulce, que generalmente son tolerantes a la contaminación32. Finalmente, cabe mencionar la recuperación de esporas de hongos de siete individuos de los periodos Neolítico y CA. Algunas de las esporas se identificaron como pertenecientes a Glomus, un gran género fúngico asociado con las raíces de las plantas33, mientras que se identificaron varias esporas de levadura en dos muestras neolíticas pertenecientes a diferentes sitios, lo que probablemente sugiere el consumo de alimentos fermentados.

Para obtener más detalles sobre el análisis de microdesechos, consulte la Discusión complementaria.

Finalmente, realizamos una reconstrucción de novo ensamblando múltiples MAG, entre las cuales se identificó la más abundante como Olsenella sp. taxón oral 807 (Datos complementarios 9, Figura complementaria 13). Por lo tanto, decidimos investigar más a fondo esta especie, tanto por estar presente entre múltiples muestras pertenecientes a diferentes fases del Neolítico, como por estar ya descrita como un posible biomarcador microbiano asociado a esta transición16. Como era de esperar, el análisis filogenético indicó que los antiguos genomas de Olsenella estaban estrechamente relacionados con la referencia moderna para esta especie, pero se dividieron en dos grupos diferentes: uno compuesto por cuatro genomas reconstruidos a partir de las muestras más antiguas y el otro por dos CA muestras que estaban filogenéticamente más cerca de la referencia moderna (Fig. 5a). Algunas regiones comúnmente se pasaban por alto entre todos los genomas antiguos (Fig. 5b) y podrían estar relacionadas con elementos más recientes de la evolución. En general, se agotaron un total de 123 regiones en los genomas antiguos, correspondientes a varias familias de proteínas (Fig. 14 complementaria y Datos complementarios 10). La mayoría de las partes de estas regiones contenían solo proteínas hipotéticas. Dos grandes brechas, ubicadas en ~1900 kbp y ~2200 kbp, contenían familias de proteínas involucradas en mecanismos de defensa e interacciones con otros comensales microbianos: proteína asociada a CRISPR, antitoxina HigA, elemento móvil, proteínas de dominio Fic e integrasa/recombinasa y tetraciclina familia de resistencias (TetR).

El panel a informa el análisis filogenético de los seis genomas antiguos reconstruidos (recuadro azul claro), junto con 17 Olsenella sp. modernas. referencias, realizadas por PATRIC100. En el Panel b, es posible observar el análisis de alineación realizado con BRIG99. El círculo morado indica la Olsenella sp. taxón oral 807 referencia, mientras que los genomas antiguos se identifican por el código de las muestras a partir de las cuales se ensamblaron.

Para obtener más detalles sobre la reconstrucción del genoma, consulte la Discusión complementaria.

En los últimos años ha surgido una imagen más detallada de la antigua Europa, gracias a los esfuerzos conjuntos en los campos de la arqueología y la genética humana34,35. Sin embargo, todavía nos faltan algunas teselas del mosaico global. Por ejemplo, el conocimiento sobre la evolución del microbioma humano aún es escurridizo y fragmentario.

En el presente estudio, seguimos la evolución de los simbiontes humanos a lo largo de todo el período Neolítico, comparando el microbioma del Neolítico con el de los cazadores-recolectores del Paleolítico superior y las poblaciones posteriores de la Edad del Cobre. Observamos diferentes grupos que no habían sido detectados previamente en la literatura científica, caracterizados por perfiles microbianos orales específicos que siguen la evolución cronológica de estas poblaciones.

La mayoría de los cambios detectados en la abundancia de especies a lo largo del tiempo podrían estar relacionados con cambios en las estrategias de subsistencia (como entre cazadores-recolectores y agricultores) o con modificaciones en los elementos que constituyen la dieta neolítica. Una primera distinción se refiere a las muestras de AP, cuyos microbiomas parecen diferir claramente de los posteriores del Neolítico, desde un punto de vista taxonómico y funcional. Los microbiomas de los individuos cazadores-recolectores analizados son muy similares, a pesar de pertenecer a un largo período cronológico que abarca el último máximo glacial, y posiblemente un reemplazo poblacional en el período posterior36,37. Esto puede considerarse como el reflejo de una estrategia de subsistencia similar de larga data basada en un grado sustancial de consumo de proteínas y grasas animales, junto con alimentos con carbohidratos ricos en almidón, como sugiere la combinación de los microrrestos y los resultados funcionales aquí informados, con datos zooarqueológicos. de la cueva de Paglicci38,39. Las diferencias identificadas en las vías de los carbohidratos entre las muestras del PA y del Neolítico probablemente estén relacionadas con una variación en las fuentes de carbohidratos seleccionadas. De hecho, el análisis de microrrestos reveló un mayor grado de variabilidad taxonómica en los granos de almidón consumidos entre las muestras de AP con respecto a las muestras del Neolítico (ver Discusión complementaria), lo que está de acuerdo con la mayor abundancia de la ruta del metabolismo del almidón bacteriano. Curiosamente, se ha detectado evidencia de registros de almidón atribuibles a la avena (Avena cf. barbata) tanto en el cálculo dental de cinco individuos PA (tres gravetienses y dos epigravetianos), como en una piedra de moler desenterrada en una capa gravetiense temprana del mismo sitio. de la cueva Paglicci, proporcionando múltiples fuentes de evidencia para el consumo de esta planta en todas las fases paleolíticas consideradas38.

Por el contrario, las muestras del Neolítico se caracterizaron por un grupo restringido de granos de almidón durante todas las fases del Neolítico examinadas, y por diferentes variables taxonómicas y funcionales relacionadas con el metabolismo de carbohidratos, vitaminas y aminoácidos, así como factores de virulencia.

Desde una perspectiva taxonómica, con el comienzo de la transición neolítica, las especies que previamente habían sido mal atestiguadas durante la PA como miembros patógenos de los complejos rojo y naranja, junto con otros taxones (es decir, Olsenella sp. taxón oral 807, Parvimonas micra, Desulfomicrobium orale y Filifactor Alocis, entre otros), comenzaron a aparecer o aumentar en abundancia. Las especies bacterianas que pertenecen a los complejos rojo y naranja se coagregan y son agentes etiológicos conocidos de la enfermedad periodontal27. Llevan varios factores de virulencia (por ejemplo, fimbrias y proteasas) con capacidades proteolíticas que pueden afectar el tejido conectivo del huésped y desencadenar una disfunción de la respuesta inmune40. Recientemente, la presencia de P. gingivalis también se ha asociado con varias afecciones inflamatorias extraorales, como enfermedades cardiovasculares, diabetes y Alzheimer, y parece ejercer una influencia directa en la composición microbiana del intestino del huésped41,42,43. Por lo tanto, el aumento observado en los factores de virulencia en todas las fases del Neolítico, y especialmente durante los períodos LN/CA, se basa principalmente en el aumento de la abundancia de especies del complejo rojo. En general, las muestras del Neolítico también se caracterizaron por la presencia de metabolismo de galactosa, lo que probablemente podría estar relacionado con el consumo de productos lácteos. La galactosa se metaboliza a partir de la lactosa, un azúcar disacárido del que la leche y sus productos derivados son fuentes dietéticas primarias44, que pueden estimular el crecimiento de bacterias fermentadoras de lactosa45. En realidad, la identificación de esporas de levadura a partir del análisis de microdesechos puede sugerir el consumo de alimentos fermentados, lo que podría estar relacionado con una fuente de leche. El inicio de la explotación de productos secundarios animales se reporta generalmente para los períodos posteriores al Neolítico46, pero el consumo de leche comenzó mucho antes, como también lo confirman los restos de lípidos en las ollas, así como los registros arqueozoológicos de sitios italianos contemporáneos47. Varias características taxonómicas y funcionales no se distribuyeron por igual en todo el período Neolítico, sino que se encontró una diferencia significativa entre las fases anteriores y posteriores. Los sujetos que pertenecen a la primera parte del Neolítico (es decir, EN y MN), correspondientes a las culturas Impressed Ware y Passo di Corvo, comparten elementos taxonómicos y funcionales comunes y muestran rasgos intermedios entre los dos extremos constituidos por PA y LN-CA. Esta evidencia define las primeras fases como una especie de "estado de transición", lo que podría explicar la falta de marcadores fuertes en los análisis anteriores que se han centrado principalmente en el inicio de la transición agrícola16,48. Además, el escenario propuesto está de acuerdo con el análisis de isótopos estables, que mostró que las primeras comunidades agrícolas en el centro-sur de Italia consumían una amplia gama de alimentos, lo que demuestra la continuidad con las comunidades anteriores de cazadores-recolectores26. Por lo tanto, nuestro resultado apoyaría la hipótesis de que la transición a la nueva estrategia de subsistencia fue gradual y regionalmente específica, con una fuerte adaptación de los pueblos neolíticos que llegaron a los recursos disponibles localmente, en lugar de un cambio drástico hacia una dieta homogénea, como también se informó. por datos isotópicos y botánicos, junto con evidencias de continuidad en las prácticas culinarias en otras regiones europeas49,50,51. El sitio de Palagiano fue el único que demostró un alto grado de variabilidad dentro del sitio, que no estaba asociado con ningún metadato antropológico (por ejemplo, edad, sexo o patologías). Sin embargo, llama la atención que la evidencia arqueológica ha señalado la existencia de diferentes modelos funerarios en un mismo sitio, lo que se ha interpretado como un reflejo de la diferenciación social52. Teniendo en cuenta que la mayoría de las muestras pertenecientes al mismo entierro se agruparon en el mismo grupo (C3) según el análisis taxonómico, podemos suponer que las diferenciaciones sociales hipotéticas podrían indicar una diferencia en el acceso a los recursos o en la elección de la dieta.

Por el contrario, durante la segunda mitad del Neolítico, múltiples rasgos taxonómicos y funcionales nos llevaron a suponer la adopción de un régimen dietético alto en carbohidratos/bajo en proteínas. La mayor presencia de Capnocytophaga spp., así como de Ottowia HOT 894, Neisseria elongata y Rothia aerea, todas ellas enriquecidas en muestras de LN y CA, se ha asociado con un mayor consumo de fibra dietética, tanto en el microbioma salival vegano como en el microbioma de la placa, respectivamente17,19. Además, el microbioma oral de la población vegana moderna también demuestra un aumento en las rutas específicas de aminoácidos, como la biosíntesis de lisina, glicina y cisteína, que se enriquecieron significativamente incluso entre las muestras de LN y CA19. La presencia de estos rasgos sugiere un aumento en la ingesta de carbohidratos dentro de los períodos LN/CA, y concuerda con los datos registrados por análisis isotópicos, reportando una tendencia decreciente en la ingesta de proteína animal y un aumento en el consumo de proteína vegetal de EN a LN y CA, junto con una intensificación de las prácticas agrícolas en las comunidades agrícolas del sur de Italia al final del Neolítico25,53. Además, y siempre durante el período LN, los registros botánicos reconocieron un cambio en la selección de recursos de carbohidratos, con una reducción en la variabilidad taxonómica de cereales y leguminosas y un aumento en las plantas tolerantes a la sequía (p. ej., cebada y trigo escandinavo - Hordeum spp. y Triticum monococcum-)24. Este cambio en las prácticas agrícolas se ha asociado con condiciones ambientales específicas, más que con una elección cultural, relacionadas con la ocurrencia de dos fases climáticas secas que afectaron el sur de Italia entre los períodos FMN y LN (4500-4000 a. C.) y durante la transición de LN a CA (4000-3500 aC)24 (Fig. 15 complementaria).

Al combinar los registros botánicos con los datos isotópicos citados y nuestros resultados, planteamos la hipótesis de que las razones detrás de la alteración en la composición microbiana durante el Neolítico tardío podrían estar relacionadas con cambios en los componentes de la dieta (p. ej., cereales y plantas comestibles). Las poblaciones locales probablemente aplicaron estos cambios para hacer frente a condiciones climáticas más secas, lo que puede haber influido en la disponibilidad de las plantas alimenticias consumidas anteriormente24. Las variaciones dietéticas, que afectaron la ingesta de carbohidratos, finalmente variaron la abundancia de especies orales y la composición microbiana de la placa17.

La comunidad microbiana oral de las muestras LN/CA presenta la mayor abundancia de especies relacionadas con los complejos rojo y naranja y de factores de virulencia, lo que sugiere que los ecosistemas orales de las poblaciones LN y CA sufrieron un peor estado de salud que los de sus poblaciones recientes. ancestros. En este marco, cabe destacar que los análisis antropológicos, principalmente extraídos de artículos publicados (ver Suplemento. Discusión), informaron que la mayoría de las muestras consideradas para los períodos LN y CA se caracterizaron por una mayor incidencia de enfermedades orales. Por el contrario, las muestras de PA demostraron buenas condiciones de salud bucal, mientras que las muestras de EN/MN representaron una baja incidencia de periodontitis y caries (Datos complementarios 1). Esta tendencia también está de acuerdo con estudios previos sobre restos óseos, que ya sugerían una disminución en la condición de salud oral asociada con la transición a la agricultura54,55.

Considerando aspectos adicionales de las condiciones de salud de las poblaciones neolíticas, detectamos la presencia de diatomeas, sugiriendo el consumo de agua contaminada, lo que podría haber tenido implicaciones importantes para la salud humana56.

Finalmente, los factores adicionales que explican los cambios observados en la ecología bacteriana pueden estar relacionados con la variación genética a lo largo de la evolución del genoma simbionte, lo que podría haber afectado la interacción y adaptación de las especies. Las bacterias que viven dentro de la misma comunidad comparten principalmente interacciones negativas (es decir, competencia) en lugar de positivas (es decir, cooperación), especialmente si viven en un entorno altamente biodiverso donde la competencia por los nutrientes se vuelve más fuerte57. Las toxinas antibacterianas, junto con otros factores de virulencia, son las armas que utilizan las especies para competir, generando fuertes interacciones negativas entre ellas58. El análisis de la antigua Olsenella sp. Los genomas del taxón oral 807 detectaron una serie de elementos faltantes, en su mayoría relacionados con factores de virulencia y formación de biopelículas, en comparación con los modernos, lo que sugiere que su capacidad para competir e interactuar con otras especies orales que viven en el mismo nicho ha evolucionado recientemente. Esto, junto con la mayor presión selectiva ejercida por los cambios en la dieta, en última instancia habría afectado la ecología del microbioma oral.

En conclusión, nuestro análisis proporciona evidencia de la presencia de dos cambios principales que afectan la abundancia de varias especies de microbioma oral en las poblaciones investigadas: (i) el primero está relacionado con la transición cultural asociada con la introducción del estilo de vida agrícola en esta región , que impulsó una modificación inicial en la composición del microbioma conservando algunos aspectos de las muestras anteriores de cazadores-recolectores; (ii) la segunda, ocurrió durante el Neolítico tardío, y probablemente esté ligada a la adaptación a distintos elementos dietéticos, cuando los cambios observados en la primera fase se hicieron más prominentes y algunas especies que estaban fuertemente presentes en los cazadores-recolectores casi desaparecieron, probablemente debido a la progresiva adaptación de los agricultores a distintos elementos dietéticos.

De acuerdo con la Superintendencia de Patrimonio Cultural local, se recolectaron 79 muestras de múltiples sitios arqueológicos en la misma área geográfica (Centro Sur de Italia) donde comenzó el período Neolítico ~6200 aC, en la península. Con el fin de obtener un conocimiento profundo de todo el Neolítico, recolectamos muestras que cubrieron toda la transición, desde su inicio hasta su final, siguiendo las principales subdivisiones arqueológicas y culturales de este período: Neolítico temprano (EN, que corresponde aproximadamente a la cultura de la Loza Impresa, del VII al VI milenio a. C.), Neolítico medio (MN, correspondiente a la loza pintada del Passo di Corvo, durante el VI milenio a. C.), parte final del Neolítico medio (FMN, correspondiente a la Serra d' Loza alta pintada de finales del VI a mediados del V milenio a. C.), Neolítico tardío (LN, correspondiente a loza de Diana, de la segunda mitad del V a principios del IV milenio a. C.). Además, consideramos tanto a los individuos cazadores-recolectores previos de la misma área en el sitio de la Cueva de Paglicci (PA, correspondiente a los contextos culturales del Paleolítico superior Gravetiense y Epigravetiense) como a la fase posneolítica, denominada Edad del Cobre (CA, correspondiente a las lozas Gaudo y Laterza). Para contrastar cualquier sesgo potencial relacionado con la biogeografía oral, se tomaron muestras principalmente de los cálculos dentales molares, cuando estaban disponibles (Tabla complementaria 1)59. En la Tabla complementaria 1 y los Métodos complementarios se informa más información sobre el sitio arqueológico investigado, los antecedentes culturales y la datación por radiocarbono.

La extracción y la secuenciación del ADN se realizaron en 76 muestras en un laboratorio limpio de ADNa dedicado en el Departamento de Biología de la Universidad de Florencia (Italia), siguiendo pautas validadas para evitar la contaminación del ADN moderno60. Después de la descontaminación con luz ultravioleta durante 10 minutos, el sarro se molió grueso con una mano de mortero estéril y se trató de acuerdo con el Procedimiento A de Modi et al.61, que permite el análisis conjunto de material genético y residuos de alimentos de la misma muestra de sarro. Brevemente, después de la digestión durante la noche en 1 ml de tampón de extracción (0,45 M EDTA pH 8,0, 0,25 mg/ml de proteinasa K, 0,05 % de Tween 20), los sedimentos residuales se almacenaron para el análisis de microrrestos, mientras que el ADN se extrajo utilizando una columna giratoria de sílice específica. protocolo diseñado para recuperar moléculas cortas62. Después de centrifugar a máxima velocidad durante 2 min, el sobrenadante se incubó con 10 ml de tampón de unión (clorhidrato de guanidina 5 M, Tween 20 al 0,05 %, 2-propanol al 40 %) y 400 µl de acetato de sodio 3 M pH 5,2 en columnas de sílice (alta Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit, Roche Diagnostic – Mannheim, Alemania). Después de dos pasos de lavado con Wash Buffer (High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit, Roche Diagnostic – Mannheim, Alemania), el ADN se eluyó dos veces en 50 µL de tampón TET (EDTA 1 mM pH 8,0, Tris-HCl 10 mM pH 8,0, 0,05 % de interpolación 20). Veinte microlitros de cada extracto se convirtieron luego en bibliotecas Illumina de doble índice63,64 sin tratamiento con uracilo ADN glicosilasa (UDG) para retener las incorporaciones erróneas de nucleótidos. Se añadió una combinación única de dos índices largos de 8 bases a ambos extremos de cada biblioteca de moléculas mediante 10 ciclos de PCR. El volumen completo de la biblioteca se dividió en 4 reacciones y se usó como molde en reacciones de PCR de 100 µl que contenían tampón de reacción 1x Pfu, 2,5 U Pfu Turbo DNA polimerasa (Agilent Technologies, Santa Clara CA, EE. UU.), 250 µM cada uno de dNTP y 200 nM cada uno cebadores de indexación (cebador P5: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACxxxxxxxxACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT; cebador P7: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGT). Las condiciones de ciclado estuvieron compuestas por un paso de activación de 2 min a 95 °C, seguido de 10 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 30 s, hibridación a 58 °C por 30 s y elongación a 72 °C por 1 min, con una paso de extensión final a 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR MinElute (QIAGEN - Hilden, Alemania) y se eluyeron en 25 µl de tampón TET. Después de una verificación cualitativa y cuantitativa con Agilent TapeStation (D1000 ScreenTape y reactivos, Agilent Technologies – Santa Clara, CA, EE. UU.), las bibliotecas se agruparon en cantidades equimolares y se secuenciaron en una plataforma Illumina NovaSeq 6000 en modo de extremo emparejado con 2 × 51 + 8 + 8 ciclos65.

El análisis microscópico fue realizado en 27 muestras por el Laboratorio de Palinología de la Universidad de Florencia para las muestras del Paleolítico, y en el laboratorio DANTE-Diet and ANcient TEchnology de la Universidad Sapienza de Roma, para las muestras del Neolítico y la Edad del Cobre. Según nuestra experiencia, es posible recuperar y analizar los microrrestos, a partir del sedimento de muestra utilizado para extraer ADNa en un laboratorio limpio adecuado61. Además, se analizaron seis muestras para ambas fuentes (es decir, cálculo dental y sedimento), para comparar aún más los resultados obtenidos.

La toma de muestras de cálculo dental se realizó siguiendo el protocolo sistematizado por Sabin y Fellow Yates66, con alguna variación (p. ej., se cambiaron las cuchillas desechables después de cada extracción de muestra). Los procedimientos de extracción y descontaminación siguieron los protocolos estándar publicados66,67,68 y se llevaron a cabo en espacios limpios dedicados que no están conectados con el trabajo botánico moderno y bajo un estricto control ambiental. La limpieza se realizaba diariamente para evitar cualquier tipo de contaminación moderna. Las superficies de los bancos se limpiaron antes del análisis de cada muestra con jabón y etanol, se cubrieron con papel de aluminio y se usaron guantes de nitrilo limpios y sin almidón en todo momento. La limpieza de los cálculos se realizó bajo un estereomicroscopio, en una placa de Petri previamente lavada, con aumentos de hasta 100x. La eliminación de la suciedad mineralizada adherida a la superficie del cálculo se realizó meticulosamente, utilizando pinzas estériles para sujetar la muestra y una aguja de acupuntura fina para raspar suavemente la suciedad adherida a la capa externa de la placa mineralizada. El procedimiento se realizó utilizando gotas de ácido HCl 0,5 M para disolver las motas mineralizadas del suelo y agua ultrapura para bloquear la desmineralización, así como para lavar y eliminar los contaminantes. El suelo mineralizado extraído se almacenó en tubos de plástico para el análisis de seguimiento. Luego, el cálculo limpio se lavó en agua ultrapura hasta tres veces, para eliminar cualquier rastro de sedimento suelto, se disolvió en una solución de HCl 0,5 M y, posteriormente, se montó en portaobjetos con una solución de glicerol y agua ultrapura 50:50. Además, se recolectaron y analizaron muestras de control de las mesas de trabajo limpias y trampas de polvo con fines comparativos, para evitar cualquier tipo de contaminación moderna. Esta es una práctica que se realiza de forma rutinaria en nuestros laboratorios, incluso en momentos en que no se realizan análisis arqueológicos, para permitir una mejor comprensión del flujo de contaminaciones a través de las estaciones. No recuperamos ningún desecho que fuera morfológicamente similar a ninguno de los restos en las muestras de control ambiental. Los granos de almidón representaban una fracción muy pequeña del "polvo" del laboratorio. Los sedimentos se trataron con HCl al 10 % durante 12 h y se incluyeron en una solución de agua y glicerina al 50 % v/v. El análisis se realizó bajo microscopía de luz, bajo luz de campo claro y luz polarizada cruzada. Los microdesechos incrustados en la matriz de cálculo y en el sedimento se analizaron utilizando un Zeiss Imager2, con aumentos que van de 100x a 630x.

Para la identificación de granos de almidón arqueológicos se utilizó una colección de referencia moderna de 300 plantas nativas de la región mediterránea y Europa, junto con la literatura publicada, y con el Herbarium Centrale Italicum (FI) y muestras recolectadas del Jardín Botánico de la Universidad. de Florencia30,38. Las esporas se identificaron por comparación con la literatura disponible69. Los grupos de granos se contaron como una presencia. La nomenclatura de los fitolitos se hizo de acuerdo con ICBN 2.0.

Las secuencias metagenómicas se procesaron por su calidad, y las secuencias del adaptador se recortaron y las lecturas de extremos emparejados se colapsaron utilizando el software AdapterRemoval (v2.2.0)70 con las siguientes opciones: -minlength 30 –minquality 25 –trimns –trimqualities –collapse. Luego, las secuencias duplicadas se eliminaron con Prinseq71 (v 0.19.1) (https://prinseq.sourceforge.net/) y se analizaron con Kraken2 (v.2.0.8-beta) para la identificación taxonómica72. Creamos una base de datos personalizada, actualizada a diciembre de 2020, de genomas bacterianos, virales, arqueales y mitocondriales de la base de datos NCBI Reference Sequence (RefSeq) (https://www.ncbi.nlm.gov/refseq/). Para evitar una clasificación espuria, enmascaramos los genomas de referencia para las regiones de baja complejidad con Dustmasker (v.1.0.0) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK569845/). La salida de Kraken2 luego se analizó a través del software Bracken (v.2.5) para estimar las abundancias de lectura de especies73 (Datos complementarios 11). Este mismo enfoque se ha utilizado para las muestras metagenómicas de microbiomas antiguos y modernos de referencia utilizadas para el análisis comparativo exploratorio y se informa en la Tabla complementaria 3. Seleccionamos las especies que estaban presentes en una abundancia relativa superior a 0,02 en todo el conjunto de datos. Este tipo de filtro taxonómico se ha recomendado para reducir la posible influencia de especies de baja abundancia y especies únicas presentes en el conjunto de datos, y es más adecuado que el enfoque clásico de rarefacción74,75. Gracias al umbral aplicado obtuvimos 49 especies que posteriormente fueron validadas por su perfil de desaminación y así confirmar su antigüedad. Alineamos cada lectura de muestra con sus respectivos genomas de referencia depositados en la base de datos NCBI RefSeq, utilizando solo las especies informadas como "referencia" o "representante". Para ello se utilizó el programa Burrows-Wheeler Alignment (BWA v.0.7.15)76, utilizando el algoritmo aln con alta rigurosidad (-n 0.1). A continuación, se investigó el perfil de desaminación de citosina de las secuencias alineadas mediante PMDtools (v.0.60) (–threshold 1 –requiremapq=30) (https://github.com/pontussk/PMDtools). Para cada una de las especies alineadas, convertimos los archivos bam a bed usando bedtools (https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/) y estimamos la distancia de edición (-tag NM) que se usó posteriormente para calcular la edite el algoritmo de distancia (–Δ%), para confirmar aún más la autenticidad de la secuencia77. Como se informó anteriormente, evaluamos –Δ% > 0,8 como auténticos, para evaluar posibles eventos de transferencia horizontal o la presencia de especies genéticamente estrechamente relacionadas dentro del microbioma de las muestras78. Toda la información sobre el perfil de desaminación y –Δ% para cada especie y todas las muestras se informa en la Tabla complementaria 4. Evaluamos más el nivel de fragmentación de lecturas y las diferencias en el perfil de desaminación en todos los diferentes períodos aquí investigados, para observar el efecto de los eventos tafonómicos a lo largo del tiempo (Figuras complementarias 4 y 5).

Para investigar el alcance de la posible contaminación moderna y para autenticar las fuentes orales de nuestras muestras antiguas, comparamos los perfiles de microbioma obtenidos con los de las muestras metagenómicas modernas y antiguas. Los microbiomas modernos fecales, del suelo, de la piel y orales (tanto el cálculo dental como la placa) se recuperaron del Archivo Europeo de Nucleótidos, mientras que se generaron nuevos controles ambientales y de laboratorio (Tabla complementaria 3). Dos muestras de suelo muestreadas directamente en las regiones de Apulia y Marche, y con dos controles de laboratorio (es decir, de los procesos de extracción y secuenciación). Además, los microbiomas orales antiguos informados previamente de otros estudios se agregaron como controles adicionales. Investigamos las posiciones de nuestras muestras con respecto a referencias modernas y antiguas a través de una escala multidimensional no métrica de distancias de Bray-Curtis, basada en la distribución de especies usando el paquete phyloseq (v.1.30.0) del software R (v. 3.6.3) ( Discusión complementaria). Además, estimamos el porcentaje de la fuente oral en nuestro conjunto de datos, usando Sourcetracker (https://github.com/danknights/sourcetracker), considerando un subconjunto de microbiomas modernos obtenidos de la metagenómica de escopeta usando la plataforma Illumina, y que tienen >10 millones se lee como fuentes (SI, Fig. 2 complementaria). Las muestras que demostraron una alta fuente oral (>75%) se retuvieron para el análisis. Finalmente, para eliminar posibles contaminantes, comparamos las especies identificadas con la base de datos del microbioma oral humano (HOMD) para asegurar la selección de especies orales humanas conocidas. En este sentido, la única especie cuestionada fue Burkholderia pseudomallei, que es una bacteria ambiental y agente causal de la melioidosis en humanos79. El género Burkholderia se ha detectado en la cavidad oral humana y en la placa dental80,81, pero no se ha descrito evidencia previa de B. pseudomallei para el cálculo dental, por lo que no podemos excluir que su presencia pueda estar relacionada con un contaminante antiguo o no.

El resultado de Bracken se usó para investigar la distribución de especies entre muestras usando el software R (v. 3.6.3). En primer lugar, los datos se normalizaron mediante una transformación de relación logarítmica centrada (clr), introducida por Aitchison, utilizando el paquete microViz (v.0.9.0). Esta transformación hace que los datos sean simétricos, invariantes a escala y linealmente relacionados, colocando los datos en un espacio de coordenadas log-ratio82. Este enfoque es uno de los más adecuados para normalizar datos de composición83. Para explorar la existencia de cualquier grupo posible dentro de nuestra cohorte a través de un enfoque no supervisado, realizamos la estadística de brecha a nivel de género, que es un método estándar que determina la cantidad de conglomerados en un conjunto de datos84. Aplicamos la función clusGap del paquete cluster (v.2.1.0)85 para calcular la bondad de la medida de agrupación en un objeto phyloseq (v.1.30.0)86 con un arranque de 100. Luego, usamos NetCoMi (v .1.0.2)87 para generar una red para investigar la relación compartida por las muestras basada en la distancia de Aitchison a nivel de género, que es más estable para el subconjunto y la agregación de los datos, y por ser una verdadera distancia lineal83. Los datos se dispersaron con el algoritmo k-vecino más cercano (k-nn) y se aplicó un análisis de agrupamiento jerárquico, utilizando el método de enlace promedio y el valor k obtenido por la estadística de brecha (método = "promedio", k = 5). Utilizamos el análisis de red para resaltar las conexiones entre las muestras (no solo su distancia) e identificamos los grupos existentes en función de la composición del microbioma de las muestras. Para corroborar aún más este enfoque con un análisis más clásico, realizamos PCoA utilizando la distancia de Aitchison y realizamos PERMANOVA y ANOSIM para validar la subdivisión de grupos identificada por red; también verificamos la posible influencia de los recuentos de lectura, la extracción y el lote de la biblioteca. Aplicamos Adonis por pares (https://github.com/pmartinezarbizu/pairwiseAdonis) para resaltar las diferencias entre pares de clústeres.

Para comprender cuál de los pocos metadatos disponibles (es decir, el período, el sitio, la edad de la muerte o el sexo) puede haber desempeñado un papel importante en la distinción de grupos, aplicamos una clasificación de bosque aleatorio con 100 árboles, utilizando el paquete radiante ( v.1.4.0) (https://github.com/radiant-rstats/docs). Random Forest identificó la influencia relativa de cada característica en el modelo creado para clasificar el resultado del grupo. Para validar el modelo de clasificación obtenido del análisis de bosque aleatorio, realizamos una prueba de asociación utilizando la función assoc del paquete vcd (v. 1.4-9) que calcula el valor de chi-cuadrado (X2) de Pearson, que está diseñado para evaluar la desviación de un modelo de independencia en datos categóricos.

Para explorar e identificar las especies que cambiaron significativamente en abundancia a lo largo del tiempo, aplicamos un doble enfoque. Comparamos la composición de los conglomerados usando DESeq2 (v.1.26.0), aceptando como significativas solo aquellas especies que mostraron una p < 0.05 ajustada y que mostraron significación de más de una comparación, para evitar posibles resultados significativos espurios. Luego, para resaltar las asociaciones más fuertes de especies con conglomerados y variables de período, realizamos un análisis multivariado por modelo lineal (MaAsLin v.1.0). Este marco estadístico aplica un modelo lineal general para detectar las asociaciones entre los metadatos clínicos y los taxones microbianos, y se usa ampliamente en los estudios epidemiológicos modernos88. Los parámetros que se aplicaron para este análisis fueron los siguientes: una tasa máxima de descubrimiento falso (umbral de significación) igual a 0,05; un mínimo para el filtrado de abundancia relativa de características igual a 0,001; un mínimo para el filtrado de prevalencia de características igual a 0,01. Las especies diferencialmente abundantes se reagruparon en función de su pertenencia a los complejos ecológicos que constituían la comunidad microbiana oral27.

Además del perfil taxonómico, evaluamos si los cambios en la composición del microbioma pueden corresponder a diferencias en el perfil funcional a través de un análisis del contenido de genes realizado con HUMAnN 2.089. Evaluamos el perfil de contenido genético en nuestras muestras y las reagrupamos utilizando UniRef90_ko. Para evitar sesgos en el contenido de genes relacionados con contaminantes modernos, se filtraron los perfiles obtenidos, seleccionando las especies que previamente se validaron como auténticamente antiguas. Comparamos las distribuciones de ortólogos KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) obtenidas utilizando LEfSe (v.1.0)90 y seleccionamos solo los resultados con p < 0,05 y LDA superior a 2. En cuanto a la identificación del factor de virulencia (VF), los genes detectados como significativos se compararon con una base de datos personalizada que contenía información de la base de datos de factores de virulencia (VFDB) generada por Chen et al.91.

En general, los gráficos se generaron con ggplot2 (v.3.3.5)92, con una paleta para daltónicos93.

La reconstrucción de un genoma oral antiguo se llevó a cabo siguiendo las recomendaciones de Wibowo et al. pipeline9 para la validación de contigs. Cada muestra se ensambló usando SPAdes94 (v.3.15.3) con la opción --meta. Cada muestra se asignó a los contigs ensamblados relativos usando Bowtie2 (v.2.3.5.1)95 con la configuración predeterminada. Los resultados se indexaron y clasificaron a través de SAMtools (v.1.9)96 y los archivos BAM generados se agruparon secuencialmente con MetaBAT 2 (v.2.12.1)97. Se realizó una evaluación de la calidad del ensamblaje a través de un flujo de trabajo específico del linaje en CheckM (v.1.1.6)98, probando la integridad del genoma, el nivel de contaminación, la cobertura, los valores N50, la longitud media del contig y el tamaño del contig más grande (consulte la Tabla complementaria S5). Los contigs ensamblados luego se usaron para la identificación taxonómica con Kraken2. Solo los genomas con un nivel de completitud superior al 85%, un nivel de contaminación <5% y una identificación taxonómica >95% fueron considerados para el siguiente análisis. Finalmente, para evaluar el perfil de daño del ADNa, se usó el script Damageprofiler.sh de Wibowo et al. se usó pero la última parte del script se modificó usando PMDtools. En la figura complementaria 13 se informó un gráfico del perfil de desaminación para cada muestra. La alineación de contigs con la referencia se realizó con BLAST Ring Image Generator (BRIG) (v.0.95) 99, utilizando umbrales de identidad superior e inferior de 70% y 30 %, respectivamente. Este software se usó para generar tanto la Fig. 5 como la Fig. 14 complementaria, esta última contiene la anotación genética de referencia recuperada por la base de datos NCBI.

Luego, los contigs se cargaron en PATRIC (v.3.6.12) 100 para su posterior anotación, análisis filogenético y de proteoma. En particular, los seis genomas reconstruidos se anotaron por sus características genómicas dentro del espacio de trabajo PATRIC utilizando RASTtk101. El árbol filogenético se construyó mediante RAxML (v.8.2.11)102, utilizando 23 referencias de genomas modernos y 159 genes. A continuación, se empleó una herramienta de comparación de proteomas para investigar la similitud de proteínas antiguas con la referencia madre y para identificar funciones y regiones faltantes. Utiliza el algoritmo BLASTP para comparar secuencias de proteínas como únicas, un mejor éxito unidireccional o un mejor éxito bidireccional en comparación con el genoma de referencia. La herramienta Protein Family Sorter se utilizó para investigar la distribución de familias de proteínas que cruzan el límite de género (PGF) entre muestras antiguas con respecto a la referencia moderna.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos de secuencia generados para este estudio se han depositado en el archivo de lectura de secuencia (SRA) de NCBI bajo BioProject PRJNA791766. Los datos procesados, los datos de microscopía, así como los datos de ensamblaje y anotación del genoma están contenidos en el documento y sus archivos de datos complementarios. Las muestras arqueológicas se recogieron en la "Superintendencia de Arqueología, Bellas Artes y Paisaje de la Ciudad Metropolitana de Bari" en Bari (Italia), en la "Superintendencia de Arqueología, Bellas Artes y Paisaje de las Provincias de Barletta-Andria-Trani y Foggia " en Foggia (Italia), en la "Superintendencia de Arqueología, Bellas Artes y Paisaje de las Marcas" en Ancona (Italia), en el "Museo delle Origini" de la Universidad "La Sapienza" en Roma (Italia), y en el museo "Museo de las Civilizaciones" en Roma (Italia). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código está disponible en https://github.com/AndreaQ7/HuME y en Zenodo103 (https://doi.org/10.5281/zenodo.7198970).

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Descargar referencias

Agradecemos al Dr. Matteo Tuzzato por su apoyo con los servidores. Agradecemos a los arqueólogos y antropólogos de la "Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per la Città metropolitana di Bari", de la "Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per le Province di Barletta- Andria -Trani e Foggia" y de la "Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio delle Marche" que han entablado una fructífera colaboración. Agradecemos a A. Palma di Cesnola por su investigación en Grotta Paglicci ya G. Capecchi por contribuir en la organización de los restos humanos. También agradecemos al personal del SMA - Museo di Storia Naturale di Firenze (Herbarium Centrale Italicum y Jardín Botánico) por proporcionar materiales de referencia. Este proyecto ha sido financiado por el programa STARS 2019 de la Universidad de Padua para AQ (Italia). Los análisis realizados en el Departamento de Biología de la Universidad de Florencia fueron cubiertos por una subvención interna de la Universidad de Florencia (Progetto estratégico di Ateneo anno 2014 n. 129323 el 10/05/2015 asignado a ML). El análisis de los microdesechos en el cálculo dental neolítico ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del Programa Marco Horizonte 2020 (Starting Grant Project HIDDEN FOODS grant agreement no. 639286 to EC).

Estos autores contribuyeron igualmente: Italo Maria Muntoni, Martina Lari.

Departamento de Biomedicina Comparada y Ciencia de los Alimentos, Universidad de Padua, Legnaro, 35020, Italia

Andrea Quagliariello, Gabriel Innocenti y María Elena Martino

Departamento de Biología, Laboratorio de Antropología Molecular y Paleogenética, Universidad de Florencia, Florencia, 50122, Italia

Alessandra Modi, Valentina Zaro, David Caramelli y Martina Lari

Departamento de Ciencias Antiguas, Universidad "Sapienza" de Roma, Roma, 00185, Italia

Cecilia Conati Bárbaro

Departamento de Ciencias Físicas, de la Tierra y Ambientales, UR Prehistoria y Antropología, Universidad de Siena, Siena, 53100, Italia

Annamaria Ronchitelli, Francesco Boschin y Stefano Ricci

Departamento de Historia Culturas Civilizaciones, Universidad de Bolonia, Bolonia, 40126, Italia

Claudio Cavazzuti

Superintendencia ABAP de la Ciudad Metropolitana de Bari, Bari, 70121, Italia

Elena Dellú y Francesca Radina

Sección de Bioarqueología - Museo de las Civilizaciones, Roma, 00144, Italia

Alessandra Sperduti y Luca Bondioli

Departamento de Asia, África y el Mediterráneo, Universidad "L'Orientale" de Nápoles, Nápoles, Italia

Alessandra Sperduti

Departamento de Patrimonio Cultural, Universidad de Padua, Padua, 35139, Italia

Luca Bondioli

Departamento de Biología, Laboratorio de Palinología, Universidad de Florencia, Florencia, 50121, Italia

Miriam Lognoli y Marta Mariotti Lippi

Departamento de Ciencias Biológicas, Geológicas y Ambientales, Universidad de Bolonia, Bolonia, 40126, Italia

María Giovanna Belcastro y Valentina Mariotti

DANTE - Laboratorio de Dieta y TECNOLOGÍA ANTIGUA, Departamento de Ciencias Maxilofaciales, Universidad "Sapienza" de Roma, Roma, 00161, Italia

Emanuela Cristiani

Superintendencia de Arqueología, Bellas Artes y Paisaje de las Provincias de Barletta - Andria - Trani y Foggia, Foggia, 71121, Italia

Italo María Muntoni

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AQ, IMM y ML concibe el estudio. AQ y AM recogieron las muestras de cálculo dental. AM y VZ realizaron la extracción y secuenciación de ADN supervisados ​​por MLAQ y GI realizó el análisis bioinformático. MML, EC y M.Lo. realizó el análisis de microrestos. CC, ED, FR, AS, LB, MGB y VM realizaron el estudio de restos humanos de diferentes yacimientos del Neolítico y la Edad del Cobre. IMM y CCB son los responsables científicos de los yacimientos arqueológicos del Neolítico y la Edad del Cobre. AR y FB son los responsables científicos de la investigación en la Cueva Paglicci. SR llevó a cabo la identificación anatómica y el estudio de los restos humanos de la cueva Paglicci. AQ, AM, EC, MML y ML escribieron el documento con el aporte de VZ, CCB, AR, FB, DC, MEM e IMM. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Andrea Quagliariello o Alessandra Modi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Nicolas Rascovan y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

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Quagliariello, A., Modi, A., Innocenti, G. et al. Los microbiomas orales antiguos respaldan los cambios dietéticos graduales del Neolítico hacia la agricultura. Nat Comun 13, 6927 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34416-0

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Recibido: 03 Marzo 2022

Aceptado: 25 de octubre de 2022

Publicado: 22 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34416-0

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