Vitrificación automatizada de crio - Taiwán piedra blanca Co., Ltd

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 2985 (2022) Citar este artículo

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Detalles de métricas

La velocidad y la eficiencia de la recopilación de datos y el procesamiento de imágenes en microscopía crioelectrónica han aumentado durante la última década. Sin embargo, las técnicas de preparación de especímenes criogénicos se han retrasado y se necesitan dispositivos de preparación de especímenes más rápidos y reproducibles. Aquí, presentamos un dispositivo de vitrificación con manejo de muestras altamente automatizado, que solo requiere una interacción limitada del usuario. Además, el dispositivo permite la inspección de películas delgadas mediante microscopía óptica, ya que el exceso de líquido se elimina mediante succión mediante tubos, no papel secante. En combinación con el control del punto de rocío, esto permite la preparación de películas delgadas de manera controlada y reproducible. La ventaja es que la calidad de la muestra criogénica preparada se caracteriza antes de la adquisición de datos de microscopía electrónica. La practicidad y el rendimiento del dispositivo se ilustran con resultados experimentales obtenidos por vitrificación de suspensiones de proteínas, vesículas lipídicas, células bacterianas y humanas, seguidas de imágenes mediante análisis de partículas individuales, tomografía crioelectrónica y microscopía de luz y electrónica criocorrelacionada.

La criofijación en agua vítrea (hielo amorfo) mediante la congelación rápida de muestras biológicas puede ofrecer una conservación estructural casi perfecta de muestras biológicas como suspensiones de proteínas, virus, bacterias y células eucariotas. La criofijación requiere una velocidad de congelación lo suficientemente alta (>100.000 °C/s) como para evitar la formación de hielo (cristal). Como resultado, el agua adopta un estado transitorio metaestable, amorfo, similar al vidrio1. Mediante la vitrificación, la estructura de las proteínas y las células se puede conservar en su entorno hidratado nativo hasta la resolución atómica. Las muestras vitrificadas son compatibles con las condiciones de vacío requeridas para la microscopía crioelectrónica (cryo-EM), y también se pueden estudiar con microscopía de luz de criofluorescencia óptica (cryofLM)2. La microscopía óptica y electrónica correlativa (CLEM)3 reúne las ventajas de EM (alta resolución, contexto estructural) con las ventajas de la amplia gama de técnicas de microscopía óptica disponibles (imágenes en vivo, etiquetado versátil)4,5.

Se demostró que la vitrificación mediante congelación por inmersión con etano líquido o una mezcla de etano/propano como criogénico6 es un enfoque práctico para la criopreparación de muestras biológicas de hasta 10 micrones de espesor1,7. Para la crio-EM, las suspensiones de virus y proteínas purificadas se conservan en finas capas de agua que miden varias decenas de nanómetros, a partir de las cuales se pueden determinar reconstrucciones de resolución atómica utilizando SPA8,9. Las estructuras más grandes, como bacterias y células adheridas de hasta unas pocas micras de espesor, también son adecuadas para la vitrificación. Las reconstrucciones tridimensionales con resolución molecular se pueden determinar mediante tomografía crioelectrónica (crio-ET) de muestras de hasta aproximadamente media micra de espesor10,11. Es importante minimizar el grosor de la capa de líquido, ya que el medio que rodea la muestra dispersa los electrones, lo que aumenta el ruido de fondo de las imágenes y, por lo tanto, reduce la relación señal-ruido en las imágenes y reduce la resolución alcanzable en las reconstrucciones tridimensionales resultantes.

El paso esencial de generar una capa delgada de muestra líquida en un soporte de muestra de microscopía electrónica para EM (típicamente una capa de carbón perforada sostenida por una rejilla de cobre de 3,05 mm de diámetro) es problemático, ya que las capas delgadas de agua son intrínsecamente inestables y tienen un control exacto sobre el el espesor de la capa de agua es difícil. Se descubrió que convertir la película de soporte en hidrófila mediante descarga luminiscente en aire o alquilamina12,13 ayuda a formar una fina capa líquida sobre la película de soporte y un entorno húmedo saturado ayuda a estabilizar la fina capa. La práctica común actual es aplicar varios microlitros de solución de muestra a una película de soporte descargada luminiscente, seguido de eliminar el exceso de líquido con papel de filtro que posteriormente se congela por inmersión14,15.

Sin embargo, este método tiene varios desafíos. Primero, es difícil controlar el espesor de la capa de agua y determinar su distribución sobre la red. Debido a que el espesor de la capa de agua está influenciado por muchos factores, incluidas las propiedades del soporte, la muestra (tipo, concentración, tampón, solutos, etc.) y las condiciones ambientales (temperatura y humedad)16, los parámetros óptimos a menudo se encuentran a través del tiempo. -consumo de prueba y error que implican ciclos iterativos de congelación y análisis por cryo-EM. En segundo lugar, se pierden cantidades relativamente grandes de muestra durante el proceso, ya que la mayor parte de la muestra es absorbida por el papel secante, lo que da como resultado que quede menos de un por mil de la muestra en la rejilla17. En tercer lugar, se informa que el uso de papel secante puede tener efectos desventajosos, como agregación y desnaturalización de proteínas18,19. Además, la aplicación manual de muestras, el manejo de pinzas y la transferencia entre contenedores y diferentes máquinas consumen mucho tiempo y requieren una gran capacitación y habilidades del usuario. Debido a que las aplicaciones actuales de vanguardia de crio-EM incluyen la carga robótica de muestras de múltiples cuadrículas, el registro de datos altamente automatizado20,21 y el procesamiento de imágenes sobre la marcha22, la velocidad y la calidad de la preparación de muestras se han convertido en cuellos de botella en el proceso general.

Se han propuesto y desarrollado métodos de preparación de muestras alternativos a la transferencia, que incluyen la aplicación de cantidades mínimas de una muestra mediante rociado23,24, dosificación por inyección de tinta25,26, escritura microcapilar18 o impresión con aguja de contacto27. Estos métodos no necesitan eliminar el exceso de líquido de la rejilla y la valiosa muestra se utiliza de manera eficiente. Además, los sistemas de vitrificación desarrollados recientemente están altamente automatizados y minimizan los pasos relacionados con los problemas de manipulación, repetibilidad y velocidad. Algunos inconvenientes de estos sistemas son que la distribución de la muestra sobre la rejilla es espacialmente limitada o que se necesitan rejillas especializadas para una buena distribución28. Además, la mayoría de los sistemas son adecuados para la vitrificación de suspensiones, pero no están diseñados específicamente para trabajar con muestras mucho más grandes, como células adherentes o bacterias. Además, ninguno de estos métodos aborda la resolución de ciclos de prueba que consumen mucho tiempo entre la vitrificación y la evaluación de calidad por cryo-EM29.

Aquí nos propusimos desarrollar un dispositivo de vitrificación para criomicroscopía que (i) permita determinar la usabilidad de una muestra vitrificada antes de realizar criomicroscopía, (ii) sea compatible con todo tipo de muestras (proteínas, bacterias y células), (iii) ) produce rejillas de manera reproducible con un espesor de hielo de muestra controlable, y (iv) tiene un alto grado de automatización. Presentamos un dispositivo de congelación por inmersión que cuenta con una amplia automatización del proceso de preparación de muestras, incluido el manejo de la rejilla, la descarga luminiscente, el control de líquidos criogénicos y la aplicación de muestras. El dispositivo utiliza la extracción de muestras por succión, no con papel de filtro, y permite la inspección visual de la rejilla durante la formación de una película delgada. La observación de patrones de interferencia por microscopía óptica, en combinación con el control de la temperatura del punto de rocío de la rejilla, permite un control preciso del espesor de la capa de agua y la determinación del momento óptimo para la vitrificación. La monitorización óptica de la formación de películas finas antes de la inmersión demostró ser un método utilizable y fiable para la evaluación de la calidad antes del lento análisis crio-EM. Los resultados que informamos aquí muestran que el dispositivo se puede utilizar para la vitrificación de proteínas, liposomas, virus, bacterias y células para técnicas de microscopía de una sola partícula, tomográfica y crioelectrónica CLEM.

El émbolo Linkam es un dispositivo altamente automatizado que prepara muestras en una rejilla de soporte EM para criomicroscopía electrónica de transmisión. Las características clave son que la aplicación de la muestra se realiza por inmersión de la rejilla en la solución de muestra, el ajuste del espesor de la película de muestra se realiza recuperando lentamente la rejilla de la solución de muestra seguida de succión. La temperatura del punto de rocío del aire de la rejilla se controla y la formación del espesor de la capa de agua en la rejilla se inspecciona (y registra) en vivo mediante microscopía de luz de transmisión y/o reflexión. El flujo de trabajo de este sistema Linkam difiere de otros flujos de trabajo de inmersión de rejillas debido a los pasos posteriores de recuperación de rejillas de una caja de almacenamiento, descarga de incandescencia, aplicación de muestras, eliminación de líquidos, vitrificación (muestra sumergida en una solución criogénica) y carga en una caja de almacenamiento de criógeno. se realizan automáticamente (Fig. 1). En otros dispositivos de congelación por inmersión, es decir, Thermo Fisher Scientific Vitrobot y Leica EM GP, el paso más importante se sitúa entre la transferencia y la vitrificación (que determina el grosor de la muestra) y está determinado por un parámetro de tiempo preestablecido. En el émbolo Linkam, todos los pasos están automatizados, excepto la selección del grosor de la muestra, lo que permite una sincronización precisa de la vitrificación.

Descripción general esquemática del flujo de trabajo de los dispositivos de inmersión convencionales (arriba) en los que la descarga luminiscente y la aplicación de muestras no están integradas con la extracción automática de muestras y la posterior inmersión. En el enfoque de Linkam (abajo), todos los pasos están integrados en un flujo de trabajo automatizado. En este enfoque, la aplicación de la muestra no se realiza mediante pipeteo, sino sumergiendo la rejilla en la solución, y la extracción de la muestra no se realiza mediante transferencia con papel de filtro, sino mediante succión con un tubo. El proceso de formación de capas delgadas se sigue en vivo y solo el momento de la inmersión se realiza manualmente, exactamente al contrario del flujo de trabajo tradicional.

El diseño de la sección criogénica del émbolo Linkam (Fig. 2) está relacionado con el de la platina criogénica Linkam CMS 19630. El émbolo contiene un (1) contenedor de almacenamiento de nitrógeno líquido (Fig. 2 a izquierda); (2) una región central (cubierta) que contiene el recipiente criogénico, la cámara ambiental y la unidad de descarga luminiscente (Fig. 2b, c); (3) una cámara digital y una lente de microscopía óptica ×10 (respectivamente detrás y delante de los contenedores); (4) pinzas móviles y controladas mecánicamente (sobre las cámaras), todas montadas en (5) un marco de aluminio que contiene las unidades eléctricas y las bombas. El émbolo Linkam y la cámara están conectados a una computadora portátil con software de control (no en la figura).

un diseño de émbolo Linkam con contenedor de nitrógeno líquido (izquierda), control de pinzas (arriba) alrededor de las cámaras centrales (recuadro blanco). b Cámaras centrales con una cámara criogénica (izquierda), cámara ambiental (centro) y descargador luminiscente (derecha) y lente (abajo). c La cámara criogénica se llena con nitrógeno líquido del contenedor de nitrógeno líquido (ver a) y contiene una caja de almacenamiento de rejilla criogénica y un contenedor de etano líquido (todavía de la Película complementaria 1, para mayor claridad, no se muestran la tubería de gas etano ni la cubierta de latón) , la cámara ambiental central contiene dos posiciones para contenedores de muestras y un lugar para tres rejillas. En el centro hay un 'bloqueo de pinza' con control de temperatura que enfría la pinza mientras coloca la rejilla en posición para la eliminación de agua mediante tuberías de succión (no mostradas) y la inspección visual simultánea por la lente. d Cuadro de cuadrícula para tres cuadrículas. e Bloque de temperatura controlada con recipientes para muestras y bloqueo para pinzas y hendidura para posicionamiento de rejilla para tubos de succión y microscopía óptica.

El Dewar de nitrógeno líquido (Fig. 2a) contiene hasta 200 ml de nitrógeno líquido que puede llenarse a través de un embudo y protegerse con una tapa con un tubo aislante abierto para la salida de gas nitrógeno (no presente en la Fig. 2). El nitrógeno líquido dentro del Dewar es monitoreado por un sensor de temperatura y el nivel en la cámara criogénica se mantiene constante con una válvula que controla el llenado.

La cámara criogénica (Fig. 2b, c) contiene una ubicación para colocar una caja de almacenamiento de rejilla criogénica hecha a medida, que puede contener tres rejillas vitrificadas para transporte y almacenamiento y el contenedor de etano líquido. El baño de etano y los tubos de llenado de gas asociados (no mostrados) tienen temperatura controlada para permitir la condensación automática del gas etano. El nivel y la temperatura constantes (a -183 °C) se mantienen para que el baño de criógeno líquido evite la congelación del etano. Dado que la cámara criogénica es relativamente pequeña, la parte superior de la cámara criogénica está protegida por una placa de cobre enfriada (Fig. 2b) para mantener la temperatura criogénica de la fase gaseosa.

La cámara ambiental (Fig. 2b, c) tiene temperatura controlada por un elemento Peltier y puede ajustarse entre 3 y 50 °C. El fondo de la cámara puede contener unos mL de agua desmineralizada para generar humedad por evaporación. El área de la cuadrícula contiene una caja de cuadrícula extraíble (Fig. 2c, d) que puede almacenar hasta tres cuadrículas EM que se pueden recoger y usar para la descarga luminiscente y la aplicación de muestra posterior. Como alternativa, contiene una caja con células cultivadas de forma adherente en rejillas EM en líquido. La cámara ambiental también contiene dos posiciones para recipientes de aplicación de muestras líquidas. Una configuración de microscopio integrado con lente ×10 con modos de luz LED transmitida y reflejada puede generar imágenes de la rejilla EM dentro de la cámara de humedad mientras la pinza que sujeta la rejilla se inserta en el "bloqueo de pinza" frente a la lente. Este 'bloqueo de pinzas' de latón con control de temperatura (Fig. 2e) contiene una ranura a través de la cual las pinzas con la rejilla se pueden colocar en un cilindro hueco. Aquí, la rejilla se coloca para la extracción simultánea de muestras a través de imágenes de microscopía óptica y de succión. Un módulo de succión intercambiable con hasta tres tubos de succión se coloca contra el borde exterior de la rejilla para eliminar el exceso de líquido. La temperatura del "bloqueo de la pinza" se establece a una temperatura más baja que la de la cámara, de modo que la punta de la pinza y la rejilla se pueden configurar alrededor del punto de rocío para controlar la evaporación del agua y, por lo tanto, el espesor de la capa de agua y, al mismo tiempo, evitar un cambio en la concentración de la muestra. .

La unidad de descarga de incandescencia tiene tres posiciones para rejillas que se ubican entre dos electrodos. El volumen se bombea automáticamente a 1,8 × 10−1 mbar en un minuto utilizando una pequeña bomba de vacío sin aceite. La descarga de resplandor se realiza automáticamente de acuerdo con los ajustes programables, normalmente en 2 min a 5 mA en el aire.

La preparación del émbolo Linkam para su uso se realiza encendiendo todas las unidades eléctricas (enfriador de agua Peltier, calentador de lentes, émbolo y PC de soporte), conectando o llenando todos los consumibles (cilindro de gas etano, nitrógeno líquido en el Dewar, agua en el medio ambiente). cámara, caja de almacenamiento de rejilla en el contenedor criogénico, rejillas EM en el cartucho de recolección de rejilla, muestra líquida en el contenedor de muestra) e iniciar el software de control del émbolo y la cámara e iniciar el protocolo de llenado de etano líquido. En la Nota complementaria 1 se presenta un protocolo detallado.

La preparación de la rejilla criogénica se realiza automáticamente después de iniciar la secuencia programada (Película complementaria 1). Primero, las pinzas recogen una rejilla y la transfieren a la unidad de descarga luminiscente donde se libera y se vuelve hidrofílica en plasma de aire. A continuación, la rejilla de descarga luminiscente se recoge de nuevo y se transfiere al recipiente lleno de muestra donde la muestra se aplica a la rejilla sumergiéndola en el líquido de muestra con temperatura controlada. Se necesita un mínimo de 10 µL para llenar el recipiente de muestra. Al sumergir, <0,5 µL se aplica realmente en la rejilla, que es <2–3 µL que generalmente se usa para la aplicación manual. El tiempo de remojo de la rejilla, así como la velocidad de retracción de la rejilla del contenedor de líquido, son programables. Posteriormente, la rejilla se coloca frente a una lente de microscopía de luz × 10 con control de temperatura mediante las pinzas. La punta de la pinza y la rejilla sostenida en ella tienen control de temperatura en esta configuración porque la pinza toca el "bloqueo de pinza" de latón con control de temperatura, establecido unos pocos grados por debajo del punto de rocío de la temperatura de la cámara ambiental. Luego, un módulo de succión que contiene dos o tres tubos se coloca frente a la rejilla, tocando el borde de la rejilla, y al activarse se succiona el exceso de líquido con un caudal ajustable y calibrado. Simultáneamente, el grosor de la capa de agua en la rejilla es monitoreado visualmente por el microscopio con la cámara adjunta y el operador activa el momento de la transferencia al contenedor de etano líquido y la vitrificación por inmersión en función de la imagen de la cámara en tiempo real. Después de la vitrificación, la rejilla se transfiere a la caja de almacenamiento de rejilla criogénica o a un casete criogénico para obtener imágenes de criofluorescencia en la etapa criogénica CMS196V3.

Para proporcionar una vista de la cuadrícula para la observación con microscopía de luz en tiempo real, se usaron tubos para eliminar el exceso de líquido de la cuadrícula EM en lugar de papel de filtro (Figs. 3 y 4, Película complementaria 3). La observación al microscopio óptico del "líquido a granel" en la rejilla después de la aplicación de la muestra por inmersión no da como resultado ninguna característica específica que conduzca a una estimación del espesor de la capa de agua (Fig. 3a). Cuando el agua se diluye, comienzan a surgir patrones de interferencia de película delgada coloreada, generados por la interferencia de la luz que emana de la interfaz aire-agua en el lado de carbono de la rejilla y la película de carbono (Fig. 3b). Tras una mayor eliminación del fluido, estas franjas de interferencia coloreadas desaparecen, cuando la distancia entre la superficie del agua y la capa de carbono se vuelve inferior a ~ 200 nm (Fig. 3c). Después de una mayor eliminación de líquido, aparece un patrón de luz en forma de cruz cuando se forma el depósito de menisco en el costado de la rejilla (Fig. 3d). En ese momento aparece un disco brillante en el centro del cuadrado (Fig. 3e) porque el espesor de la capa de agua en el centro se reduce a aproximadamente menos de una micra (como se observa en la transparencia de electrones resultante después de la vitrificación). A los lados, un menisco de agua más grueso todavía está unido a las barras de la rejilla, apareciendo en un borde oscuro (Fig. 3f). Tras una mayor eliminación de agua, esta agua también podría eliminarse por completo (no se muestra aquí), pero según nuestra experiencia, también se seca el centro de la rejilla. Las observaciones de Cryo-EM mostraron que solo los dos últimos 'estados' tienen, después de la vitrificación, una capa de agua vitrificada transparente a los electrones (Fig. 3e y f), mientras que los otros estados exceden la profundidad de penetración de los electrones, lo que resulta en cuadrados negros en el crio -Imágenes EM. Por lo tanto, el momento óptimo para la vitrificación es cuando los cuadrados de la cuadrícula, cuando se observan al microscopio óptico, parecen tener una región central brillante y un anillo exterior oscuro. Para obtener un gran campo de visión en nuestros experimentos, utilizamos principalmente una lente de objetivo ×10. Sin embargo, el uso de una lente ×20 permitió observar más claramente las diferencias entre los agujeros abiertos y los cubiertos de agua (usando una lámina de carbono Quantifoil 2/2), lo que permitió determinar con mayor precisión el punto de vitrificación, a expensas del conocimiento sobre el espesor. variación de la capa de agua sobre la rejilla (Fig. 3C complementaria).

Evaluación del espesor de la película por LM en tiempo real y crio-EM. Primeras dos columnas: observaciones LM (resumen de cuadrícula, cuadrado de cuadrícula), tercera columna: vista crio-EM del mismo cuadrado después de la vitrificación, última columna: vista lateral esquemática figura explicativa de un cuadrado con barras de cuadrícula en marrón claro, capa de carbón en gris y superficies líquidas en líneas azules. a Justo después de la aplicación de la muestra por inmersión, la solución de muestra a granel está presente en ambos lados de la rejilla y no se pueden observar características específicas mediante microscopía óptica. La descripción general esquemática muestra la superficie del líquido (líneas azules), las barras de la cuadrícula (beige) y la capa de carbono en un lado de la cuadrícula (gris). b Después de eliminar el agua, aparecen anillos de interferencia de color, presumiblemente debido a la interferencia de la luz entre la superficie del agua y la capa de carbón en el lado de carbón de la rejilla. Las líneas de interferencia pueden aparecer dentro de un cuadrado, pero también pueden abarcar varios cuadrados. c Los patrones de interferencia desaparecen y cerca de los bordes de la cuadrícula, la apariencia cambia ligeramente debido al contacto de la capa de agua con las barras de la cuadrícula. d En el centro de los cuadrados de la cuadrícula aparece un punto más claro, presumiblemente porque la superficie del agua adopta una forma cóncava dentro del cuadrado. e Nuevamente, están surgiendo anillos de interferencia, ahora debido a la interferencia entre la otra capa de agua y la capa de carbono (ver Película complementaria 3). El punto más claro representa capas de agua que son más delgadas que unos pocos cientos de nanómetros: imágenes crio-EM este cuadrado muestra regiones centrales transparentes a los electrones. Las regiones más oscuras en los bordes de la imagen LM son probablemente el resultado de rayos de luz refractados hacia las barras de la cuadrícula y absorbidos por ellas. f La región central se expande en la imagen LM. Cryo-EM muestra una expansión de la región transparente de electrones mientras aparece un borde suave en los bordes. Las vistas como en e y f son el momento adecuado para la vitrificación y dan como resultado cuadrados de cuadrícula utilizables para imágenes crio-EM. Un criterio visual bueno y simple es que el marco negro alrededor del cuadrado de la cuadrícula retrocede nuevamente después de sobrepasar el área más grande como se muestra en (e).

una descripción general de LM de la cuadrícula EM con muestra líquida (arriba, último fotograma de la película antes de la vitrificación) y b descripción general crio-EM de la cuadrícula después de la vitrificación (arriba). Los números 1, 2 y 3 en ayb denotan los mismos cuadrados de cuadrícula que muestran la apariencia en LM y EM de diferentes espesores de muestra. El grosor óptimo de la muestra se logra alrededor de la posición 2. Tenga en cuenta que en b, recuadro 3, la mayoría de los orificios de la película de soporte no están cubiertos por una capa de hielo, y b, recuadro 2, contiene más orificios utilizables en la película de soporte para la adquisición de datos. Los círculos blancos indican las posiciones de los tubos de succión.

Los experimentos iniciales mostraron que la succión de fluido con un solo tubo de succión colocado en el lado inferior de la rejilla dio como resultado un gradiente de espesor pronunciado entre los cuadrados llenos de agua y los cuadrados secos. Como consecuencia, en cualquier momento durante el proceso, solo un número muy limitado de cuadrados mostró el grosor deseado que era adecuado para la recopilación de datos. Para obtener más cuadrados con un espesor óptimo y una mejor distribución sobre la rejilla, probamos varios diseños de tubos de succión. Parecía que colocar dos tubos de succión en los lados izquierdo y derecho de la rejilla daba los mejores y más reproducibles resultados (Fig. 2 complementaria). La apariencia, la calidad y la facilidad de uso general para la recopilación de datos de las cuadrículas producidas (Fig. 4) fueron comparables a las vitrificadas en nuestro laboratorio utilizando Thermo Fisher Scientific Vitrobot o Leica EM GP.

Dado que la eliminación de agua se realiza desde los lados de la rejilla, mientras que en la posición (central) de la punta de la pinza, el agua suele quedar retenida en la rejilla, se crea un gradiente de espesor que permite la sincronización adecuada de la vitrificación para producir una gran área de rejilla utilizable. cuadrícula. Hay que decir que la propia muestra (composición, viscosidad, tensión superficial) influye en cómo se comporta este gradiente y cuánta agua queda retenida en la rejilla. Asimismo, el tipo de rejillas (malla, vendaje, espesor) y la calidad (arrugas, desgarros, agujeros) de la capa de carbón así como el tipo de película de carbón (lacey o quantifoil: cantidad y tamaño de agujeros), influye en el comportamiento del agua en la rejilla durante el adelgazamiento de la capa por succión. Sin embargo, las diferencias individuales entre rejillas y muestras no influyeron en la calidad de las rejillas vitrificadas. Durante la preparación, cada muestra se evalúa individualmente.

Además, la observación de LM permitió la observación de varios fenómenos que resultaron útiles para evaluar la calidad de la red. En primer lugar, se pudo observar la agregación de proteínas y vesículas en la rejilla durante la eliminación del agua por succión. Los agregados en el rango de tamaño de micras conducen a variaciones locales de espesor de la superficie del agua que se traducen en variaciones de contraste que pueden ser observadas por LM. La agregación de proteína dentro de los agujeros en la lámina no se pudo observar en la configuración actual. Además, ocasionalmente se observaron parches hidrofóbicos en la lámina de carbono por retracción no uniforme de los bordes del agua (Fig. 3 complementaria).

Aunque la inspección visual de los cuadrados de la cuadrícula en la imagen óptica antes de la inmersión es una indicación útil de la calidad y la usabilidad de la cuadrícula vitrificada resultante mediante crio-EM, el espesor de la película de hielo sobre los agujeros en la capa de carbono es de importancia clave. Los orificios individuales de dos micrómetros de diámetro en las cuadrículas EM Quantifoil R2/2 se pueden observar con una lente ×10 NA 0.25 en combinación con una cámara digital de 5 MP, lo que permite investigar si los orificios permanecen cubiertos con agua o se abren debido a la gran superficie. tensión. La tendencia general fue que en los cuadrados con agua en sus bordes, los agujeros en la película de carbón están cubiertos. Cuando hay poca agua en los bordes exteriores del cuadrado, los agujeros están abiertos, no cubiertos de agua.

Si bien la presencia de agua a granel se controla mediante succión, las capas delgadas de agua inherentemente inestables son sensibles a la humedad relativa de su entorno. Dado que el instrumento no tiene un control de humedad activo (para aumentar la humedad ambiental y reducir la evaporación), la rejilla está rodeada por una humedad variable de alrededor del 79 % (típica en los Países Bajos). Por lo tanto, la punta de la pinza y, por lo tanto, la rejilla se enfriaron unos pocos grados por debajo de la temperatura establecida en la cámara ambiental utilizando un "bloqueo de pinza" (Fig. 2c) para mantener la rejilla en el punto de rocío y evitar la evaporación18. De esta manera, pudimos controlar la evaporación del agua de la rejilla y mantener estados favorables para la vitrificación (Fig. 3e y f) durante varios minutos (Fig. 4 complementaria y Película complementaria 2).

Para validar el rendimiento del dispositivo de vitrificación, probamos una variedad de muestras y técnicas. Aparte de adaptar las concentraciones de la solución, no optimizamos ningún parámetro y todas las muestras se realizaron en unas pocas sesiones de vitrificación. Para el análisis de partículas individuales crio-EM, vitrificamos apoferritina recién purificada y preparamos algunas rejillas. De una de las cuadrículas, registramos varios miles de imágenes y determinamos una reconstrucción de 2.4 Å en la que pudimos encajar la estructura de rayos X (entrada PDB 6RJH) (Fig. 5a).

a Resultados del análisis de partículas individuales para apoferritina (n = 1). Imagen crio-EM típica de la recopilación de datos (izquierda), reconstrucción 3D de apoferritina a una resolución de 2,4 Å (centro) y ajuste de la estructura de rayos X de la apoferritina del bazo de caballo (PDB 6rjh en amarillo) en la densidad EM (derecha). b Cryo-ET en cubos de origami de ADN (n = 1). Vista crio-EM de varios orificios en lámina de carbono perforada (izquierda) y de la distribución de partículas dentro de un orificio (centro izquierda), un corte a través del volumen del tomograma que muestra la parte superior de las cintas de ADN (centro derecha) y una superficie 3D Representación de 12 cubos de origami de ADN (derecha, coloreados individualmente). c Cryo-EM de vesículas lipídicas (n = 5). Descripción general de Cryo-EM que muestra el grosor del hielo en un cuadrado de malla de cuadrícula EM que se usa normalmente para la recopilación de datos (izquierda) y una descripción general de la distribución de vesículas dentro de un orificio en la película de carbono (centro izquierda), un corte a través de un volumen de tomograma de una vesícula de varias capas (centro a la derecha) y la representación de la superficie en 3D de las capas de lípidos individuales (a la derecha, con capas de lípidos coloreadas).

Para Cryo-ET, vitrificamos cubos de origami de ADN. Esta es una muestra que tiende a agregarse y adherirse a la interfaz aire-agua. Aunque la agregación no se redujo significativamente, pudimos realizar crio-ET. La reconstrucción tomográfica mostró claramente el ADN como las cintas del cubo (Fig. 5b). En otro experimento, destinado a obtener imágenes crio-EM 2D de vesículas liposomales, se vitrificaron vesículas de anfotericina B (Ambisome®). Las imágenes crio-EM de estas muestras mostraron buenas distribuciones de orificios cubiertos dentro de un cuadrado de cuadrícula y se obtuvieron buenas imágenes de muchos orificios (Fig. 5c, dos paneles izquierdos). Las muestras también se prepararon crio-ET en vesículas multilamelares, revelando múltiples capas de membrana de las vesículas (Fig. 5c, dos paneles derechos).

Además de ser adecuado para suspensiones de proteínas y liposomales, el dispositivo de vitrificación también permite la preparación de células. Esto se demuestra mediante la vitrificación y la crio-ET de las suspensiones de bacterias E. coli y 17 células de ratón del clon 1 que se cultivaron de forma adherente en rejillas EM doradas (Fig. 6a, b). Finalmente, también realizamos crio-CLEM en estas células eucariotas, teñidas con fluorescencia con Mitotracker, mediante imágenes crio-LM posteriores (Fig. 6c, izquierda) y crio-EM adicional (Fig. 6c, centro, derecha).

crio-microscopía electrónica de bacterias. Descripción general típica de cryo-EM de un cuadrado de malla única de una muestra bacteriana que muestra el grosor del hielo y la distribución de bacterias (izquierda) y una vista dentro de un orificio en la película de carbono (derecha). b Descripción general típica de crio-EM de un cuadrado de malla única de células cultivadas en una cuadrícula EM (izquierda) e imagen crio-EM en una parte delgada de la célula que muestra vesículas internas y mitocondrias con inclusiones típicas ricas en fosfato ricas en electrones (derecha) . c Cryo-CLEM de células. Descripción general de la imagen de microscopía de luz criogénica de la parte central de una cuadrícula de búsqueda que es una superposición de una imagen de campo oscuro (blanco) y una imagen de fluorescencia (verde) de células marcadas con fluorescencia (izquierda), superposición de la imagen de fluorescencia cryoLM sobre el crio -Vista general de EM (blanco) (centro), el rectángulo rojo indica la posición del cuadrado de malla que se muestra con mayor aumento (derecha).

Tuvimos dos incentivos principales para desarrollar y construir este dispositivo de vitrificación para la preparación de muestras crio-EM. Un primer objetivo era hacer que el proceso de vitrificación fuera más consistente, menos dependiente del usuario y más fácil de controlar. Por lo tanto, los pasos de manejo de la cuadrícula se automatizaron, desde recoger una cuadrícula EM (fuera de la caja de cuadrícula personalizada; Fig. 1d) hasta colocar una cuadrícula crio-EM completamente procesada en un contenedor criogénico para almacenamiento (y para imágenes cryoLM en casetes especializados )30. Al integrar también la descarga luminiscente y la aplicación de muestras, se minimiza la interacción del usuario con la rejilla, lo que tiene la ventaja de que se minimiza la degradación (arrugas) o la pérdida de la rejilla. Para aumentar la comodidad de uso, la licuefacción del gas criogénico (etano o etano/propano) y el mantenimiento de los niveles de líquido criogénico (etano y nitrógeno) están completamente automatizados.

Un segundo objetivo era preparar rejillas crio-EM con un grosor más reproducible de la capa de agua vítrea y obtener información directa sobre el grosor y la distribución de la muestra en la rejilla durante la preparación. Tener conocimiento previo sobre el grosor de la capa de agua vítrea y la usabilidad general de la muestra criogénica preparada, antes de realizar la imagen de microscopía electrónica criogénica, evita los ciclos de preparación de muestras y control de calidad de la rejilla que consumen mucho tiempo en la microscopía crioelectrónica. Para acceder a la información de la capa de espesor durante la eliminación del agua, nos abstuvimos del uso de papel de filtro, que oscurece la vista en la rejilla, y en su lugar decidimos utilizar la aspiración para eliminar el exceso de líquido, haciendo uso de varios tubos que se colocan en el borde exterior de la rejilla de microscopía electrónica. Usando succión, tanto la velocidad como la duración de la eliminación del líquido se pueden regular fácilmente, en contraste con el papel de filtro convencional, ya que la velocidad de eliminación es una propiedad intrínseca del papel. Nuestro método tiene la ventaja adicional de que elimina cualquier influencia potencial del papel de filtro en la química de la muestra18,31. Una gran ventaja de la configuración actual que usa aspiración de líquido es que permitió colocar una lente de microscopía óptica con cámara e iluminación para los modos de reflexión y transmisión alrededor de la cuadrícula y observar la cuadrícula durante la extracción de la muestra. Los experimentos iniciales que utilizaron una lente ×20 proporcionaron un campo de visión relativamente grande en aproximadamente 45 cuadrados (5 × 9 cuadrados, 423 × 762 µm) con una vista utilizable de los agujeros de 2 micrones. La configuración actual y preferida utiliza una lente ×10 (16 × 26 cuadrados; 1,35 mm × 2,2 mm con una cámara mejorada de 20 MP) que proporciona una vista menos detallada de orificios individuales de 2 micras pero ofrece una vista relativamente grande correspondiente a aproximadamente 70% del área total de la cuadrícula que se puede observar en EM.

La comparación de la microscopía óptica registrada durante la preparación y la criomicroscopía electrónica resultante de las rejillas vitrificadas demostró que el espesor del agua vitrificada en crio-EM se podía estimar cualitativamente mediante microscopía óptica. A partir de imágenes de microscopía óptica, las áreas que son electrolúcidas en crio-EM podrían identificarse fácilmente e incluso podría observarse la diferencia entre los agujeros vacíos y llenos de agua en el carbono. Aunque el tiempo entre la última observación de LM y la vitrificación toma hasta un segundo, es lo suficientemente rápido como para que no aparezcan muchos cambios. El espesor resultante de las capas de agua vitrificada no se midió cuantitativamente, pero según el tamaño de las partículas en las diferentes muestras y los datos tomográficos, estimamos que las capas de agua vitrificada resultantes varían entre alrededor de 50 y 200 nm. En conjunto, la observación con microscopía óptica de la interferencia de películas delgadas brinda una buena estimación para un punto de tiempo adecuado de vitrificación y da como resultado rejillas con un espesor de capa de agua vitrificada que son prácticamente utilizables.

Aunque la interferencia de la capa fina de luz blanca puede proporcionar información detallada sobre el grosor de la película32, en la configuración actual con transmisión y luz reflejada, no se puede determinar el color exacto. Además, las películas delgadas por debajo de ~100 nm son incoloras y solo cambian de intensidad, lo que no se puede relacionar con un grosor específico, ya que están enmascaradas por las diferencias de intensidad de fondo. Sin embargo, el análisis cuantitativo de películas delgadas en el rango de 50 a 200 nm es importante para determinar el espesor óptimo para crio-EM de partículas pequeñas de alta resolución y sería una característica deseable para una configuración de émbolo. Con métodos de detección y análisis de resolución espectral apropiados, el espesor cuantitativo de la película líquida podría determinarse ópticamente. En principio, se demostró el análisis de color de interferencia utilizando luz de tres longitudes de onda33 o una combinación de holografía e interferometría34 para la medición óptica de película delgada de campo completo. Aunque medir películas por debajo de 100 nm de espesor probablemente necesitará longitudes de onda más cortas.

El agua a granel se puede eliminar de manera eficiente del borde de la rejilla mediante succión utilizando dos o tres tubos. Esto resultó en un espesor de la capa de agua distribuida ligeramente variable sobre la rejilla, con las áreas más gruesas cerca del centro de la rejilla y la punta de la pinza, y las áreas más delgadas cerca de la periferia de la rejilla. Esta variación del espesor del hielo es deseable y asegura que en cada cuadrícula esté presente un número mínimo de cuadrados utilizables. La optimización de la velocidad de succión es posible, pero en nuestras manos esto no era necesario.

Dado que la inspección visual brinda un conocimiento previo sobre la calidad y la usabilidad de las cuadrículas para crio-EM, solo las cuadrículas buenas se transfieren al TEM y se utilizan para la adquisición de datos y tenemos un rendimiento perfecto de las cuadrículas, descartando las cuadrículas ocasionales que no se comportaron. bien durante el adelgazamiento, p. ej., debido a la flexión o la rotura de la película de soporte, antes de la inmersión. Para muestras de proteína purificada y liposomales, dentro de una sola cuadrícula, normalmente un tercio de los cuadrados (especialmente alrededor de la posición de los tubos de succión) está demasiado seco e inutilizable para la recopilación de datos, un tercio es utilizable (la gran mayoría de los agujeros de aluminio están cubiertos con agua vítrea) y un tercio tiene aproximadamente el mismo número de agujeros de lámina vacíos y llenos, lo que hace que el número utilizable de cuadrados por cuadrícula varíe entre el 30 % y el 60 % (n = 16). Para rejillas con bacterias y células adherentes el rendimiento fue mucho mejor ya que el agua se retiene mejor alrededor de estas estructuras y son menos sensibles al secado.

Si bien es valioso tener un conocimiento previo del grosor de las capas de agua vítrea y la distribución y la cantidad de superficie utilizable en una cuadrícula antes de realizar la crio-EM, este no es el único requisito previo para tener cuadrículas utilizables de alta calidad y buen comportamiento para la recopilación de datos. . Además, para la recopilación de datos de SPA, la calidad de la muestra en términos de orientación preferencial, agregación, concentración en la superficie de la rejilla y alteración de proteínas35 son parámetros importantes para optimizar la rejilla, que parece evadir la detección por microscopía óptica. Parecía que se podía observar una gran agregación de proteínas o vesículas en la rejilla con la configuración de microscopía de luz actual, muy probablemente a través de las variaciones de espesor de la superficie del agua. No estudiamos esto más a fondo, aunque nos gusta señalar que se proponen técnicas de LM para la investigación de la agregación de proteínas36,37, y podría valer la pena explorar el uso de métodos de LM espectroscópicos o de fluorescencia adicionales durante la preparación de muestras de películas delgadas.

A diferencia de otros dispositivos de preparación de muestras desarrollados recientemente29, no intentamos minimizar la cantidad de muestra utilizada para la aplicación en la rejilla. En cambio, aquí optamos por desarrollar un dispositivo con una amplia aplicabilidad y, por lo tanto, evaluamos su usabilidad para una variedad de muestras diferentes. Se utilizó apoferritina como estándar de flujo de trabajo SPA para evaluar la resolución de la reconstrucción. Usando una sola sesión de vitrificación, pudimos preparar 9 cuadrículas de tres muestras, de las cuales usamos una, sin ninguna optimización para el espesor del hielo, para una recopilación de datos durante la noche que condujo a un mapa 3D de resolución de 2,4 Å. También preparamos muestras de cubos de origami de ADN para cryo-ET. Se sabe que este tipo de muestra se agrega fácilmente y se adhiere a las superficies de aire y agua. Nuestros experimentos dieron resultados muy similares en comparación con los experimentos que utilizan otros dispositivos de vitrificación. En la misma sesión también preparamos muestras para crio-EM en varios tipos de liposomas, lo que demostró que estas muestras se pueden preparar fácilmente sin mucho esfuerzo ni optimización. Más importante aún, junto a la suspensión de partículas, también se podrían preparar células bacterianas y celulares para imágenes crio-EM y crio-CLEM. Las muestras preparadas y los resultados de crio-EM no se distinguían de las mismas muestras que se prepararon con Leica EM GP y Thermo Fisher Scientific Vitrobot Mark IV, a pesar de las grandes diferencias en el diseño y el nivel de automatización.

Por razones de bioseguridad, es importante evitar la liberación de sustancias nocivas. Además, es importante evitar la contaminación cruzada entre muestras. Nos dimos cuenta de que sin una limpieza adecuada de las puntas de las pinzas o el cambio de los tubos de succión, se puede producir una contaminación cruzada de las muestras entre las rejillas que se producen posteriormente. La limpieza y la descontaminación se pueden lograr mediante una combinación del uso de elementos intercambiables, enjuague y medidas de esterilización en autoclave a alta temperatura. Los recipientes de inmersión de muestras, así como los cartuchos de recogida de muestras, son intercambiables y se pueden esterilizar en autoclave o desechar, todos los tubos de silicona son desechables y se pueden intercambiar fácilmente. La alineación de los baños de inmersión es flexible y los pasos de enjuague o limpieza para la punta de la pinza se pueden configurar en el software y automatizar. El conjunto de pinzas, el tubo de succión de acero inoxidable y los módulos mecánicos en las inmediaciones de la muestra durante el proceso de succión se pueden cambiar o quitar fácilmente y esterilizar en autoclave. La cámara de humedad se puede enjuagar con, por ejemplo, alcohol isopropílico, acetona o etanol y el diseño tiene radios grandes para facilitar la limpieza. Aunque no formaba parte del prototipo probado en este documento, hemos agregado y probado filtros HEPA y canales de escape calentados a alta temperatura (~200 °C) para inactivar los componentes biológicamente activos en las versiones más nuevas.

El dispositivo presentado en este documento está altamente automatizado y durante la preparación, la interacción del usuario solo es necesaria para determinar el momento deseado para la inmersión. Los desarrollos futuros incluyen la detección automática del momento óptimo para la vitrificación. Los resultados experimentales informados aquí indican que las franjas de interferencia de película delgada, que aparecen, cambian y desaparecen mientras se reduce el espesor de la capa, brindan una indicación directa y clara del espesor de película resultante después de la vitrificación de la muestra, son fáciles de juzgar por el usuario. Si bien en la configuración actual la decisión de cuándo sumergirse la toma el usuario, prevemos que en el futuro esta decisión se implementará a través de un sistema de visión artificial convencional o basado en IA. Además, con la detección y el análisis con resolución espectral, el espesor cuantitativo de la película líquida se puede determinar ópticamente, lo que hace que el proceso de vitrificación sea completamente independiente del usuario.

La apoferritina de bazo de caballo se adquirió de Sigma (9013-31-4) y se purificó inmediatamente antes de la vitrificación mediante filtración en gel en una columna Superdex 200 Increment 3,2/300 (Cytiva) en NaCl 150 mM. Tris 25 mM pH 7,5, tampón DTT 2 mM. La fracción del pico se recogió y utilizó para la preparación de la muestra a una concentración final de 2,5 µM.

Se prepararon liposomas que contenían dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), colesterol y DNP-cap-PE (44:5:50:1% en moles) como se describió previamente en 2019 por Lubbers et al. 38. Los lípidos (Avanti Polar Lipids, AL, EE. UU.) se disolvieron en cloroformo-metanol (9:1 v/v) y se secaron bajo un flujo de gas nitrógeno durante la noche. Se obtuvo una concentración lipídica final de 0,8 mg/ml, al rehidratar la película lipídica en sulforrodamina B 20 mM (S1402; Sigma Aldrich, Missouri, EE. UU.) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 a 37 °C durante 30 min. . La mezcla de lípidos rehidratados se sometió a ultrasonidos durante 5 min a 37 °C para formar liposomas, que se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna NAP-25 preempaquetada (17-0852-01; GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). Los liposomas se mezclaron con 5 µg/ml de anticuerpos monoclonales IgG1 DNP39.

Se usó anfotericina B liposomal (Ambisome®) en formulaciones como se describió anteriormente40,41 después de una dilución 10x en agua.

Los cubos de origami de ADN se diseñaron utilizando TALOS42 utilizando los ajustes preestablecidos de cubo estándar con una longitud de borde de 84 nucleótidos. Las soluciones de plegado se prepararon en tubos de PCR mezclando M13mp18 ssDNA (20 nM, Bayou Biolabs) con las grapas de ssDNA apropiadas (200 nM de cada grapa, Integrated DNA Technologies; consulte Datos complementarios 1) complementadas con 20 mM MgCl2 en un volumen total de 50 l Los cubos de origami de ADN se templaron térmicamente en un termociclador Bio-Rad C1000 Touch™ usando el siguiente protocolo: 80 °C hasta 76 °C a una velocidad de 5 min/°C, 75 °C hasta 30 °C a una velocidad de 13,75 min/0,5 °C, 29 °C hasta 20 °C a razón de 10 min/°C. Se agruparon diez soluciones de plegamiento de 50 μL y posteriormente se purificaron y concentraron utilizando filtros centrífugos Amicon® ultra de 0,5 mL (MWCO: 100 kDa).

Se prepararon células de ratón 17Clone1 como se describió anteriormente43 y se marcaron con fluorescencia durante 1 h con MitoTracker™ (M7514, Invitrogen) a una concentración final de 0,5 µM a partir de un stock de 1 mM en DMSO. Todas las muestras se prepararon en rejillas de cobre de malla Quantifoil 300 con película de carbono R2/2.

Las rejillas se cargaron en un Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) operado a 300 kV, equipado con un detector de electrones directos Gatan K3 BioQuantum. Se adquirieron películas con 50 cuadros y una dosis acumulada de 65 e/Å2 en modo de conteo utilizando el software EPU (Thermo Fisher Scientific) con una ampliación de ×105 000, correspondiente a un tamaño de píxel calibrado de 0,836 Å/píxel con un rango de desenfoque de − 0,6 a -2,5 µm. Se recopilaron un total de 2348 películas en dos sesiones de microscopía en el Centro de Nanoscopía Electrónica de los Países Bajos (NeCEN). Los parámetros detallados de adquisición de datos se resumen en la figura complementaria 1 y la tabla complementaria 1.

Se utilizó el software RELION-3.1 beta44,45 para todo el procesamiento de imágenes. Brevemente, las películas recopiladas se sometieron a corrección de deriva inducida por haz utilizando MotionCor246, la función de transferencia de contraste se estimó mediante CTFFIND-4.1.1847. El selector gaussiano RELION se utilizó para seleccionar automáticamente 689 633 partículas. Después de dos rondas de clasificación 2D, se descartaron los falsos positivos y las características contaminantes, lo que dio como resultado un conjunto de datos de 91 000 partículas. Se usó un mapa de apoferritina previamente determinado filtrado a 40 Å como referencia para el refinamiento 3D. El conjunto final de 91.000 partículas se sometió a refinamiento CTF para correcciones de aberraciones ópticas y de inclinación del haz, así como desenfoque por partícula, corrección de astigmatismo por micrografía seguido de pulido bayesiano45,48. A continuación, se realizó un segundo refinamiento 3D que produjo un mapa de 2,4 Å. Las resoluciones de los mapas se estimaron con el criterio de 0,143 de la curva FSC corregida por aleatorización de fases calculada entre dos semimapas refinados de forma independiente multiplicados por una máscara de disolvente de bordes suaves. Las reconstrucciones finales se afilaron y filtraron localmente en el posprocesamiento RELION. El modelo de rayos X de apoferritina de bazo de caballo (entrada PDB 6RJH49) se ajustó a la densidad EM mediante el uso de la función "ajustar en el mapa" dentro de UCSF Chimera50 versión 1.13.1 después de disminuir el tamaño de píxel del mapa EM de 0,836 a 0,82 Å/píxel para un mejor ajuste. Los mapas se mostraron usando UCSF 1.13 y ChimeraX51.

Las imágenes crio-EM se registraron en un FEI Tecnai T12 Biotwin con fuente LaB6, operando a 120 keV en una cámara CCD FEI Eagle 4k × 4k, utilizando un soporte criogénico de entrada lateral Gatan 626. Para la correlación con la última imagen LM registrada antes de la vitrificación, se registraron a mano imágenes de bajo aumento (<×200), cubriendo toda la cuadrícula. Las vistas generales de imágenes compuestas de toda la cuadrícula y las superposiciones con las imágenes LM se realizaron en Adobe Photoshop.

Cryo-ET se realizó en un Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) operado a 300 kV, equipado con un detector de electrones directos Gatan K3 BioQuantum. Las series de inclinación se registraron utilizando el software TOMO 4 (Thermo Fisher Scientific) entre −56° y +56° con un paso de inclinación de 2°, comenzando en 0°, con una dosis total de 100 e/Å2 y 16 fotogramas por imagen a una aumento nominal de ×19,500, correspondiente a un tamaño de píxel calibrado de 4,4 Å/píxel con un desenfoque de −7 µm. Las series de inclinación de la tomografía crioelectrónica se reconstruyeron utilizando el software IMOD52,53. Las representaciones de la superficie se realizaron a mano utilizando el software Amira (Thermo Fisher Scientific).

Cryo-LM se realizó en un Zeiss Axioimager M2 equipado con un Linkam CMS196M. Pilas de imágenes fluorescentes y de luz transparente (21 cortes cada 75 µm) que grabamos usando una lente de objetivo EC PlanNeofluor ×10/0.30 Ph1 en una AxioCam MR R3 con un tamaño de píxel en el nivel de muestra de 1 µm × 1 µm. Las imágenes de campo claro se registraron utilizando una fuente de luz LED y las imágenes fluorescentes se registraron utilizando una fuente de luz HXP de 120 V con un conjunto de filtros 38 HE. Las proyecciones de intensidad máxima para ambas pilas de imágenes se realizaron con el software Zeiss ZEN 3.4 y las superposiciones se realizaron en Adobe Photoshop 2021. Cryo-CLEM se realizó en un Talos Arctica (Thermo Fisher Scientific) operado a 200 keV, equipado con un electrón directo Gatan K3 BioQuantum detector. Se realizaron correlaciones y se registraron imágenes utilizando el software MAPS (Thermo Fisher Scientific).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

El mapa crio-EM de apoferritina generado en este estudio se ha depositado en la EMDB con el código de acceso EMD-13738. Las visualizaciones de video se crearon con Adobe Premiere Pro, Maxon Cinema 4D y Maxon Redshift y están disponibles como Películas complementarias 1 y 2. Los datos que respaldan este estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente.

Dubochet, J. et al. Microscopía crioelectrónica de especímenes vitrificados. Q. Rev. Biophys. 21, 100 (1988).

Artículo Google Académico

Philips, MA y col. CryoSIM: microscopía de fluorescencia criogénica con iluminación estructurada 3D de súper resolución para imágenes ultraestructurales correlacionadas. Óptica 7, 802–812 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Howes, SC, Koning, RI & Koster, AJ Microscopía correlativa para microbiología estructural. actual Opinión Microbiol. 43, 132–138 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tuijtel, MW, Koster, AJ, Jakobs, S., Faas, FGA & Sharp, TH Microscopía de luz y electrónica de superresolución criogénica correlativa en células de mamíferos usando proteínas fluorescentes. ciencia Rep. 9, 1369 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Chang, YW et al. Microscopía de localización fotoactivada criogénica correlacionada y tomografía crioelectrónica. Nat. Métodos 11, 737–739 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tivol, WF, Briegel, A. & Jensen, GJ Un criógeno mejorado para la congelación por inmersión. microsc. Microanal. 14, 375–379 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J. y McDowall, AW Microscopía crioelectrónica de virus. Naturaleza 308, 32–36 (1984).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Yip, KM, Fischer, N., Paknia, E., Chari, A. y Stark, H. Determinación de la estructura de la proteína de resolución atómica mediante crio-EM. Naturaleza 587, 157–161 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Kato, T. et al. CryoTEM con una pistola de emisión de campo frío que lleva la biología estructural a una nueva etapa. microsc. Microanal. 25, 998–999 (2019).

Artículo Google Académico

Zhang, X. et al. Visualización de vecindades de vesículas de insulina en células beta mediante tomografía crioelectrónica. ciencia Adv. 6, eabc8258 (2020).

Bauerlein, FJB & Baumeister, W. Hacia la proteómica visual en alta resolución. J. Mol. Biol. 433, 167187 (2021).

Reissig, M. & Orrel, SA Técnica para la microscopía electrónica de suspensiones de partículas libres de proteínas por el método de tinción negativa. J. Ultrastucto. Res. 32, 11 (1970).

Artículo Google Académico

Dubochet, J., Groom, M. y Mueller-Neuteboom, S. El montaje de macromoléculas para microscopía electrónica con especial referencia a fenómenos superficiales y el tratamiento de películas de soporte por descarga luminiscente. En Avances en Microscopía Óptica y Electrónica. (Eds Barrer, R. & Cosslett, VE) 107–135 (Academic Press, Nueva York, Londres, 1982).

Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J. & McDowall, AW Microscopía crioelectrónica de especímenes biológicos vitrificados. Tendencias Bioquímica. ciencia 10, 138–176 (1985).

Artículo Google Académico

Dubochet, J., Lepault, J., Freeman, R., Berriman, JA y Homo, JC Microscopía electrónica de agua congelada y soluciones acuosas. J. Microsc. 128, 219–237 (1982).

Artículo Google Académico

Passmore, LA & Russo, CJ Preparación de muestras para crio-EM de alta resolución. Métodos Enzymol. 579, 51–86 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rubinstein, JL et al. Shake-it-off: un dispositivo ultrasónico simple de preparación de muestras crio-EM. Acta Crystallogr. Secta. D 75, 1063–1070 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Arnold, SA et al. Preparación de rejillas de criomicroscopía electrónica sin transferencias y sin pérdidas a partir de muestras de proteínas de tamaño de nanolitros y extractos unicelulares. J. Estructura. Biol. 197, 220–226 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Glaeser, RM ¿Qué tan buena puede llegar a ser la crio-EM? Nat. Métodos 13, 28–32 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Carragher, B. et al. Leginon: un sistema automatizado para la adquisición de imágenes de especímenes de hielo vítreo. J. Estructura. Biol. 132, 33–45 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cheng, A. et al. Leginon: nuevas funciones y aplicaciones. Ciencia de las proteínas 30, 136–150 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Stabrin, M. et al. TranSPHIRE: procesamiento sobre la marcha automatizado y optimizado para retroalimentación para cryo-EM. Nat. común 11, 5716 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ashtiani, D. et al. Suministro de gotas de femtolitros mediante atomización basada en ondas acústicas superficiales para la preparación de rejillas crio-EM. J. Estructura. Biol. 203, 94–101 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Feng, X. et al. Un método rápido y efectivo de rociado-sumergido de microfluidos para crio-EM de una sola partícula de alta resolución. Estructura 25, 663–670.e663 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dandey, VP et al. Spotiton: nuevas funciones y aplicaciones. J. Estructura. Biol. Rev. 202, 161–169 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B. & Potter, CS Spotiton: un prototipo para un sistema integrado de vitrificación y dispensación de inyección de tinta para cryo-TEM. J. Estructura. Biol. 179, 68–75 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Ravelli, RBG et al. Estructuras crio-EM a partir de volúmenes sub-nl mediante impresión con alfiler y vitrificación por chorro. Nat. común 11, 2563 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wei, H. et al. Optimización de rejillas de nanocables "autoabsorbentes". J. Estructura. Biol. 202, 170–174 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weissenberger, G., Henderikx, RJM y Peters, PJ Comprender las manos invisibles de la preparación de muestras para crio-EM. Nat. Métodos 18, 463–471 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Koning, RI et al. Microscopía de luz de criofluorescencia correlativa y tomografía crioelectrónica de Streptomyces. Métodos Cell Biol. 124, 217–239 (2014).

Artículo PubMed Google Académico

Glaeser, RM et al. Factores que influyen en la formación y estabilidad de especímenes crio-EM delgados. Biografía. J. 110, 749–755 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Afanasyev, YD, Andrews, GT & Deacon, CG Medición del grosor de las pompas de jabón con combinación de colores. Soy. J. física. 79, 1079–1082 (2011).

Artículo ADS CAS Google Académico

Kitagawa, K. Medición del perfil de espesor de película delgada mediante análisis de color de interferencia de tres longitudes de onda. aplicación Optar. 52, 1998–2007 (2013).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Ferraro, V., Wang, Z., Miccio, L. & Maffettone, PL Análisis cuantitativo y de campo completo de una película líquida delgada a nanoescala mediante la combinación de holografía digital e interferometría de luz blanca. J. física. química C 125, 1075–1086 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Carragher, B. et al. Resultados actuales al optimizar la preparación de muestras "estándar" para crio-EM de una sola partícula. J. Microsc. 276, 39–45 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barthélemy, D., Robert, G. & Tudor, A. Detección y caracterización de agregados proteicos por microscopía de fluorescencia. En t. J. Pharm. 329, 37–45 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Sicheng, T., Wenting, W. & Xin, Z. Visualización directa y creación de perfiles de mal plegamiento y agregación de proteínas en células vivas. actual Opinión química Biol. 64, 116–123 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Lubbers, R. et al. La carbamilación reduce la capacidad de la IgG para la hexamerización y la activación del complemento. clin. Exp. inmunol. 200, 1–11 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ugurlar, D. et al. Las estructuras de C1-IgG1 brindan información sobre cómo el reconocimiento de patrones de peligro activa el complemento. Ciencia 359, 794–797 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Adler-Moore, J. & Proffitt, RT AmBisome: formulación liposomal, estructura, mecanismo de acción y experiencia preclínica. J. Antimicrobiano. Quimioterapia. 49, 21–30 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Adler-moore, JP & Proffitt, RT Desarrollo, caracterización, eficacia y modo de acción de ambisome, una formulación liposomal unilaminar de anfotericina BJ Liposome Res. 3, 429–450 (1993).

Artículo CAS Google Académico

Jun, H. et al. Diseño de secuencia automatizada de origami de ADN de estructura alámbrica poliédrica 3D con bordes de panal. ACS Nano 13, 2083–2093 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Wolff, G. et al. Cuidado con el espacio: las juntas de microexpansión reducen drásticamente la flexión de las criolaminillas molidas con FIB. J. Estructura. Biol. 208, 107389 (2019).

Artículo PubMed Google Académico

Scheres, SH RELION: implementación de un enfoque bayesiano para la determinación de la estructura crio-EM. J. Estructura. Biol. 180, 519–530 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J., Nakane, T. & Scheres, SHW Un enfoque bayesiano para la corrección del movimiento inducido por haz en el análisis de partículas individuales crio-EM. IUCrJ 6, 5–17 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2: corrección anisotrópica del movimiento inducido por haz para mejorar la microscopía crioelectrónica. Nat. Métodos 14, 331–332 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: estimación de desenfoque rápida y precisa a partir de micrografías electrónicas. J. Estructura. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zivanov, J., Nakane, T. & Scheres, SHW Estimación de aberraciones de alto orden y magnificación anisotrópica a partir de conjuntos de datos crio-EM en RELION-3.1. IUCrJ 7, 253–267 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Naydenova, K., Peet, MJ & Russo, CJ Soportes multifuncionales de grafeno para criomicroscopía electrónica. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 116, 11718–11724 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera: un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios. J. Cómputo. química 25, 1605–1612 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Goddard, TD et al. UCSF ChimeraX: superando los desafíos modernos en visualización y análisis. Ciencia de las proteínas 27, 14–25 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kremer, JR, Mastronarde, DN & McIntosh, JR Visualización por computadora de datos de imágenes tridimensionales usando IMOD. J. Estructura. Biol. 116, 71–76 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mastronarde, DN & Held, SR Alineación automatizada de series de inclinación y reconstrucción tomográfica en IMOD. J. Estructura. Biol. 197, 102–113 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

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Agradecemos a Meindert Lamers, Willem Noteborn, Leoni Abendstein, Georg Wolff (CCB, LUMC) por la preparación de las muestras. Este trabajo se benefició del acceso al Centro Holandés de Nanoscopia Electrónica (NeCEN) en la Universidad de Leiden, un centro Instruct-ERIC. La microscopía electrónica de este trabajo forma parte del programa de investigación Hoja de ruta nacional para infraestructuras de investigación a gran escala (NEMI), número de proyecto 184.034.014, financiado por el Consejo de investigación holandés (NWO).

Microscopía electrónica, Biología celular y química, Centro médico de la Universidad de Leiden, PO Box 9600, 2300, RC, Leiden, Países Bajos

Roman I. Koning y Abraham J. Koster

Linkam Scientific Instruments Ltd, Tadworth, Surrey, KT20 5LR, Reino Unido

Hildo Vader, Martijn van Nugteren, Peter A. Grocutt, Arnold CF Kamp y Michael Schwertner

NeCEN, Instituto de Biología de Leiden, Universidad de Leiden, Edificio Gorlaeus, Einsteinweg 55, 2333, CC, Leiden, Países Bajos

Wen Yang y Ludovic LR Renault

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RIK: conceptualización, metodología, validación, investigación, redacción—borrador original, visualización, supervisión. MvN: conceptualización, metodología, validación, investigación. HV: conceptualización, metodología, validación, investigación. PAG: Software. AJK: redacción—revisión y edición, adquisición de fondos. AK: conceptualización, metodología, supervisión, captación de fondos. WJ: recopilación de datos de SPA. LLRR: análisis de datos. MS: conceptualización, metodología, redacción—revisión y edición, supervisión.

Correspondencia a Roman I. Koning.

Linkam Scientific Instruments Ltd. obtuvo la patente europea EP3018467 A1 "Preparación de muestras microscópicas" (Inventores ACFK, MvN, HV, RIK y MS); PAG es empleado de Linkam Scientific Instruments; ACFK es propietario de Linkam Scientific Instruments Ltd., Reino Unido. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a Radostin Danev y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Koning, RI, Vader, H., van Nugteren, M. et al. Vitrificación automatizada de muestras crio-EM con espesor de muestra controlable mediante succión e inspección óptica en tiempo real. Nat Comun 13, 2985 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30562-7

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Recibido: 02 Diciembre 2021

Aceptado: 26 abril 2022

Publicado: 27 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30562-7

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